绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术.docx

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1、DB15/TXXXXX-XXXX代替DB15T1238-2017绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术Thedouble-antibodysandwichenzyme-linkedimmUnosorbentassay(ELISA)fordetectionofjaagsiektesheepretrovirus(JSRV)点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局-,一、刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替DB15/T1238-2017绵

2、羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELlSA检测技术,与DB15/T1238-2017相比，除了结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：更改了规范性引用文件更改了A.4包被抗体增加了缩略语，包括CA、TM本文件由内蒙古自治区农牧业厅提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAWTC19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学。本文件起草人：刘淑英、李慧萍、张良、陈思旭、苗佳佳、刘月。本次为第一次修订。绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELlSA检测技术1范围本文件规定绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术的试剂、材料与设备、样品前处理、操作方法、结果判定等。本文件适用于内蒙古自治区检测临床疑似病羊、进

3、出境种羊外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白和囊膜蛋白，以及羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489-2008实验室生物安全通用要求IS0/TS20388:2021生物技术-生物样本库-动物生物样本保藏要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1绵羊肺腺瘤病毒绵羊肺腺瘤病毒是引起绵羊肺腺瘤的病原，病毒的囊膜蛋白是具有转

4、化细胞和致癌功能的蛋白质，位于病毒粒子的最外层，是构成病毒粒子的主要结构蛋白。3.2双抗体夹心ELISA技术指特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体一抗原一固相抗体复合物显色来检测抗原含量的技术。4缩略语下列缩略语适用于本文件。JSRV：绵羊肺腺瘤病毒(JaagSiektCSheCPrCtrOvirus,JSRV)exJSRV：夕卜源性绵羊肺月泉瘤病毒(EXOgCnOUSjaagSiCkteShecPrCtrOVirus,exJSRV)cnJSRV：内源性绵羊肺腺瘤病毒(Endogenousj

5、aagsiektesheeprctrovi11js,enJSRV)OPA:绵羊肺腺瘤病(OvinePUImonaryadenOmatosis,OPA)CA:衣壳蛋白(Capsid,CA)TM:跨膜蛋白(Transmembraneprotein,TM)ELlSA:酶联免疫吸附测定(Enzymelinkedimniunosorbentassay,ELISA)PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline,PBS)PBST:TWCCn-20磷酸盐缓冲液洗涤液(PhosphatebufferedsalinewithTwcen-20,PBST)HRP:辣根过氧化物酶(Hydroge

6、n-peroxideoxidoreductase,HRP)5试剂5.1除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682-2008中三级水的要求。52红细胞裂解液(配制见附录A中A.1)。5.3 抗体样品稀释液(配制见附录A中A.2)。5.4 包被缓冲液(配制见附录A中A.3)。5.5 包被抗体(配制见附录A中A.4)。5.6 检测抗体(配制见附录A中A.5)。5.7 洗涤液(配制见附录A中A.6)。5.8 封闭液(配制见附录A中A.7)。5.9 TMB底物显色液(配制见附录A中A.8)o5.10 底物终止液2mol/LH2SO4(配制见附录A中A.9)。6材料与

7、设备6.1 除非另有说明，实验室应符合GBT19482008中二级实验室的要求。6.2 微量加样器量程分别Q2L2此、IpL-IOuL.IOHL100jL、20uL200jL和IOoUL1000L的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。6.3 4C-20C冰箱。6.4 电热恒温培养箱。6.5 96孔酶标板。6.6 自动酶标检测仪。6.7旋涡振荡器。7样品前处理动物血液按照1S0/TS20388:2021中要求进行采集和保存。取新鲜抗凝血5mL,3000/min离心15Inid弃上清，按1：5的比例向细胞沉淀中加入4C冰箱预冷的红细胞裂解液混匀，4静置IOnli从期间上下颠倒混匀5次，1000r/

8、min离心5min,离心弃去上层红色液体，收集沉淀部分。如果沉淀还有红色，可重新加入红细胞裂解液，重复1遍；向沉淀中加入样品稀释液200UL,反复冻融或室温静置Ih使细胞破裂，期间在旋涡振荡器上振荡3-5次充分混合；100OrZmin离心5min,取上清液进行检测。8操作方法8.1 包被96孔酶标板每孔加100UL包被缓冲液稀释过的包被抗体（浓度约Q0386gmL）,4,过夜。8.2 洗涤于滤纸上拍干96孔酶标板孔内液体，用PBST洗板5次，每次3min。8.3 封闭96孔酶标板每孔加入封闭液200uL,37,孵育1h。8.4 洗涤于滤纸上拍干96孔酶标板孔内液体，用PBST洗板5次，每次3m

9、in。8.5 加待检样品96孔酶标板每孔加待检样品100UL37C,孵育lh。加入阳性对照，阴性对照和PBS空白对照。（注：阳性对照是鉴定为自然感染JSRV病毒的绵羊肺腺瘤病肺组织提取蛋白，阴性对照为未感染绵羊肺腺瘤病的绵羊健康肺组织提取蛋白）用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。8.7 加酶标抗体96孔酶标板每孔加稀释过的酶标抗体100LlL（浓度约为0.0116mgmL）,37,孵育1h。8.8 洗涤用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。8.9 显色96孔酶标板每孔加TMB显色液IoOUL避光15min30min08.10 终止96孔酶标板每孔加终止液IoOLlL。8.11 读值终止反应后将96孔

10、酶标板置于自动酶标仪上，在45Onnl波长下读取光吸收OD值。8.12 断9.1 结果分析条件设定阳性对照平均OD值/阴性对照平均OD值21,空白对照平均OD值阴性对照平均OD值，检测结果有效，否则应检查实验操作并进行重测。9.2 阳性判定标准被检样品OD值/阴性对照平均OD值221判定为阳性9.3 阴性判定标准被检样品OD值与阴性/照平均OD值21判定为阴性。附录A（规范性）试剂A.1红细胞裂解液NH4CLS29g,KHCO3LOOg,EDTA-Na2372Ing溶于IOoOnIL蒸镭水，NaOH或HCl调PH至7.4。A.2抗体样品稀释液（PBS）NaClSOg,KH2PO40.27g,N

11、a2HPO4L42g,KClo.2g溶于IOoOmL蒸储水，NaOH或HCI调PH至7.4。A.3包被缓冲液Na2CO31.599g,NaHCO32939g,溶解于800UL去离子水中,NaoH或HCI调PH至9.6,定容到1L,4C保存备用。A.4包被抗体JSRV衣壳蛋白CA抗原表位富集区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫新西兰白兔，制备包被抗体。A.5酶标抗体JSRV囊膜蛋白TM抗原表位特异区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫小鼠，制备检测抗体。用HRP标记试剂盒（试剂盒购置InnOVaBioSCienCeS公司）标记检测抗体，制备酶标抗体。A.6洗涤液（PBST）ILPBS溶液加入0.5mL吐温20（Tween-20）室温保存。A.7封闭液含5%脱脂乳的PBST溶液。A.8TUB底物显色液底物显色液A液：醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,H2O2（30%）0.3ml,dH20500mLo底物显色液B液（避光保存）：EDTA-Na20.2g,柠檬酸0.95g,甘油50mL,TMB（四甲基联苯胺）0.2g用DMSO溶解为IOmWmL后再加皿2。500mL使用时A、B液等体积混匀，或直接购自天根公司。A.9底物终止液5Z2mol/LH2SO4222mL缓缓加入到177.8mL去离子水中。