基于LC-MSMS测定人体类固醇激素的研究进展2023.docx

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1、基于LC-MS/MS测定人体类固醇激素的研究进展2023摘要类固醇激素是一类具有环戊烷多氢菲结构的化合物,是由细胞色素P450酶催化形成的,在调节机体代谢、促进性器官发育等方面起着重要作用。临床上将类固醇激素水平作为肾上腺疾病和精神类疾病的诊断指标。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术因具有高灵敏度、高通量和高专属性的特点,成为临床类固醇分析测定的首选方法。本文综述了LC-MS/MS在内源性类固醇激素测定中的应用,特别是在样品前处理、色谱条件和质谱条件方面的研究进展,为临床上类固醇激素的诊断检测提供了参考。在人体内,内分泌系统、神经系统、免疫系统共同担负生命持续的重要责任。激素则是内

2、分泌系统实现协调作用的物质基础。类固醇激素(Steroidhormone)又称苗体激素,属于激素中的一大类,其合成过程以胆固醇为前体,通过各种代谢酶的参与,在人体的肾上腺皮质、胎盘细胞的线粒体、平滑内质网和性腺中合成,产生化学结构不同的21C,19CJ8C的骨架,合成过程示于图1。根据药理作用,类固醇激素主要分为孕激素、皮质激素、性激素,它们在人体的生长、发育、生殖、以及维持体内环境稳定等方面都起着重要的调节作用。激素是通过在人体靶细胞上与受体结合而发挥作用,具有极高的专属性。当体内类固醇激素水平下降或缺乏时,机体会产生严重的症候群,甚至危及生命。因此,临床上将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断

3、指标,如先天性肾上腺增生、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、以及一些精神状态类疾病,示于图2o由于大多数激素在体内的含量极微,且化学性质差异较大,寻找一种准确、特异的分析方法成为临床疾病诊断的首要任务。图1类固醇激素在人体内的合成路径图2类固醇激素含量变化引起的临床疾病多囊卵巢 综合症5口还原酶 缺乏症先天性 忏腺皮质 增生症性胴症 发固多 原醛增在人体内,内源性类固醇激素含量一般为nmolL（皮质醇、脱氢表雄酮等）和pmolL（睾酮、雌酮等）量级,并且根据个体差异而变化,因此,低浓度类固醇激素的准确测定面临巨大挑战。目前,检测人体中类固醇激素的方法包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附法(ELlSA

4、)、化学发光免疫测定法、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。其中,质谱法在检测灵敏度和准确度方面具有明显优势，凭借高灵敏度和特异性的固有优势,LC-MS/MS可以与高通量相结合，使该分析技术成为常规诊断的理想工具。近年来,关于LC-MS法的激素检测类综述侧重点不同。GraVitte等综述了LC-MS/MS在内源性性激素定量中的应用;HaWIey等对基于LC-MS/MS测量内源性糖皮质激素进行综述,特别提到了血清、尿液和唾液皮质醇;徐玲燕等综述了LC-MS/MS在临床内源性类固醇激素分析方面的应用及进展,特别是样品前处理、色谱及质谱条件方面,并简要

5、阐述了该方法在肾上腺皮质激素及性激素测量方面的特点;金陈飞等综述了LC-MS/MS用于先天性肾上腺皮质增生症患者诊治的研究进展,明确了LC-MS/MS有避免非特异性物质干扰,解决免疫分析法的高假阳性,检测标本多样化及能够快速进行类固醇代谢谱分析的优点;鹿倩等归纳对比了近几年血液中类固醇激素常用的分析方法,为类固醇激素水平的准确测定提供了思路。本文将从样品前处理方法、色谱条件、质谱条件,以及质谱新技术进行综述,探究色谱-质谱联用技术在测定人体内类固醇激素方面的研究进展,为肾上腺相关疾病的诊断检测提供参考。1样品前处理质谱技术在临床监测中具有许多优势,但由于样本基质的复杂性,血液、尿液和头发等生物

6、样本不能直接送入质谱仪分析,需要去除样品中的大分子干扰物。因为在这些干扰物中,蛋白质会导致仪器堵塞,由盐和磷脂引起的基质效应会影响电离效率。为了减少基质干扰、净化样品,生物样本必须经过一系列的前处理过程以减少目标分析物在提取过程中的损耗,提高分析方法的准确性和灵敏度。目前,常用的样品前处理方法有蛋白质沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。随着技术的发展,近年来出现了一些新的前处理方法,如分散液液萃取、超声波辅助提取法和超分子萃取等。为了得到高回收率,将多种前处理方法相结合已逐渐受到关注。在前处理方法选择上,应考虑分析物和样本基质的性质、衡量方法的可行性、以及前处理所需的时间和

7、成本等因素。1.1 蛋白沉淀PPT是通过在生物样品中加入沉淀剂的方式使蛋白质变性沉淀,然后将目标分析物从样品中提取出来的方法。有机溶剂（甲醇、乙睛或丙酮）,酸（三氯乙酸、高氯酸、偏磷酸和铝酸）,盐（氯化铝）和金属离子（硫酸锌）等被认为是PPT中最常用的沉淀齐IJ。有机溶剂会干扰蛋白质的分子内疏水相互作用,同时减少水合作用（水化程度较低的蛋白质不易溶解）,可溶性蛋白质通常具有被亲水表面包围的疏水中心,这些蛋白质的电离状态可以通过添加酸或碱来改变。Ionita等采用LC-MS/MS法检测人血浆中皮质醇、可的松和泼尼松,该方法具有较高的特异性,准确度和精密度也均在15.0%以内。OWen等利用LC-

8、MS/MS法分析血清皮质醇,该方法适用于常规临床应用,采用硫酸锌沉淀蛋白的前处理方法,血清样本中添加皮质醇后的平均回收率为99.0%,通过与2种商业免疫测定法对比,该方法具有较高的准确度和精密度。POlSon等对比了有机溶剂、酸、盐和金属离子4种蛋白质沉淀剂,以评估不同种类沉淀剂的蛋白质去除效率,在血清与沉淀剂体积比为2：1时,乙睛、三氯乙酸、硫酸锌可分别去除92.0%、91.0%、96.0%的血清蛋白,因此认为这3种沉淀剂具有较好的沉淀效果。PPT法简单、快速,但由于提取物的灵敏度和纯净度较低,需要在方法验证阶段反复验证。对于皮质醇或者脱氢表雄酮硫酸盐,它们在人体内的含量相对较高,在前处理阶

9、段不需要考虑样本被沉淀试剂稀释的问题;相反的,对于人体中含量较少的雌二醇或者醛固酮等化合物,沉淀剂沉淀不完全会对结果产生较大影响。此外,对于某些小分子化合物,该方法并不能很好地消除基质效应,反而会产生较强的基质效应而影响质谱信号。随着前处理技术的飞速发展,PPT已作为大多数前处理程序的第一步,后续将结合LLE或SPE纯化和浓缩来实现高灵敏度。液液萃取1.LE是利用待测物在两相溶液中溶解度的不同,通过涡旋、超声、振荡等手段实现目标物的提取方法,因样品制备简单而被广泛应用。在该方法中,萃取剂的选择非常重要,关键在于所选溶剂对目标化合物的溶解度大,且不与目标物发生反应,常用的萃取剂有乙醛、叔丁基甲基

10、酸、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂,以及它们的混合溶剂。采用LC-MS/MS法检测类固醇激素含量时,朱宇清等和马晓斐等均选择叔丁基甲醛作为提取剂考察血清中皮质激素的提取效果,方法回收率分别为84.5%90.4%和86.6%102.7%;SChOfield等采用LC-MS/MS法测定血清中雌二醇和睾酮,使用正己烷和乙酸乙酯混合溶液作为萃取剂进行样品前处理,2种分析物的日内精密度和日间精密度均小于7.0%,且回收率在97.5%107.3%之间,具有较高的灵敏度,适用于临床上对人体性激素的测定;KeSki-RahkOnerl等使用2-甲基丁烷、二乙醛、正己烷和叔丁基甲醛进行LLE实验,对比不同提取溶剂对

11、雄激素和孕激素的提取效率，结果表明,用叔丁基甲醛作为提取剂对所有类固醇激素均能产生最佳的萃取回收率,为103.0%113.0%,二乙酸对孕烯醇酮、孕酮和17-羟基孕酮的提取效率均低于87.5%,而孕酮分别用正己烷和2-甲基丁烷萃取后的提取效率小于80.0%oLLE具有回收率高、基质效应小等特点,但萃取后容易产生乳化现象,使水相与有机相界面分层模糊,导致方法的回收率和重复性较差,不利于自动操作。13固相萃取SPE是20世纪后期发展起来的一项分离技术,是利用填装吸附材料将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,再用洗脱液洗脱,以达到分离和富集的目的,其适用于各种极性化合物的提取。

12、固相萃取柱的填料主要有离子交换、正相和反相等吸附材料,其中，类固醇激素在血清基质中常用反相萃取柱以达到良好的分离效果。Fanelli等采用叔丁基甲基酸结合C18固相萃取柱的前处理方法,应用质谱法准确定量了脱氧皮质酮、皮质醇等9种类固醇激素,开发并验证了同位素稀释液相色谱-串联质谱法,并将其与常规免疫测定法进行比较,此外,还建立了416名健康人群类固醇激素的参考范围。在线固相萃取可以减少样品量,提高样品回收率和处理通量,能够实现一部分的样品前处理自动化,且处理后的样品基质效应小,但对检测设备的要求较高。Li等将在线固相萃取与高分辨质谱检测器耦合同时测定血清中18种糖皮质激素,先用乙睛作为血清样品

13、的萃取剂,然后选择乙酸钱作为负载溶剂,在合成的整体柱上实现在线SPE,利用该技术测得的精密度小于12.1%,回收率在71.9%89.2%之间,该方法可用于临床手术前后类固醇激素含量的监测。目前,常用的固体吸附剂有有机聚合物、键和硅胶类、键和氧化物硅胶等,其中QaSiSHLB有机聚合物固相萃取柱在类固醇激素检测中的应用最广泛,回收率可达67.0%109.0%。近年来固相微萃取(SPME)技术也在蓬勃发展,与传统的样品前处理相比,SPME集采样、萃取、浓缩、进样于一体,减少了分析检测时间,其在测定人体类固醇激素方面的应用也在逐渐增多。SPME技术的优点是对受试者的损伤和生物体取血量较少,但因为该技

14、术的选择性差,且涂层纤维价格昂贵,目前没有得到广泛应用。总之,与PPT相比,SPE的步骤复杂;与LLE相比,SPE有着更广泛的适用性,但色谱柱成本昂贵,所以选择PPT时要综合考虑经济和时间因素。虽然SPE能够提供高回收率和良好的色谱峰,但需要更多的时间和步骤来执行,是半自动的,有时还需要使用强酸或强碱洗脱高极性分析物以获得高回收率,这不适用于质谱等检测器系统。1.4 多种前处理方法相结合类固醇激素及其代谢物是一类复杂的内源性物质,不同激素的化学性质和极性差别较大。为了降低基质效应、提高灵敏度,前处理阶段将PPT、LLE和SPE结合使用,非常适合临床复杂样本的检测。Broccardo等采用甲醇沉

15、淀蛋白结合固相萃取技术对血清样品进行前处理,利用新型微流体色谱装置结合LC-MS/MS定量分析人血清中睾酮、二氢睾酮、孕酮、皮质醇和可的松等5种类固醇激素,方法的绝对回收率大于60.0%,消除了基质效应;Taylor等通过乙睛蛋白沉淀后,用乙酸乙酯作为萃取剂,采用LC-MS/MS法分析血清中皮质醇、可的松、Il-脱氧皮质酮等13种类固醇激素,绝对提取回收率为50.0%,内标校正后评估的相对提取回收率在90.0%110.0%之间,具有较好的激素萃取效率;CarOn等采用LLE、衍生化和SPE相结合的方法,利用GC-MS/MS法同时定量分析孕激素、脱氢表雄酮等10种内源性类固醇,该方法不仅有较好的

16、重现性,而且能够在有限体积的血清中同时测定10种类固醇,有助于保存现有生物库中的重要临床样本。通过将不同的前处理方法相结合,彼此互补,最大程度地去除基质效应,可以在样品数量较少时考虑采用此方法。1.5 化学衍生法类固醇激素结构的特异性导致了电离效率和灵敏度降低。化学衍生法是在分析物上加入易电离基团,使更多的分析物带上电荷而进入质谱，提高了离子化效率,可获得更高的特异性和更好的灵敏度。对于电离效率较低的雌激素,常用丹磺酰氯作为衍生化试剂,用叱咤酸衍生化雄激素,采用LC-MS/MS分析衍生化后的雌激素和雄激素,其检测限均可达到10ngL以下。羟胺溶液衍生化反应是唯一能同时衍生化皮质激素、雌激素、雄激素和孕激素的衍生化试剂,尽管会出现同分异构体干扰、灵敏度降低等情况,但其可用于类固醇激素的高通量检测,且相比于非衍生化有着灵敏度方面的优势。Keski-Rahkonen等将150L血清样品经LLE后,以盐酸羟胺溶液作为衍生化试剂,7种类固醇激素的选择性和灵敏度均显著提高