保健食品功能检验与评价方法（2023年版）有助于改善缺铁性贫血.docx

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1、保健食品功能检验与评价方法（2023年版）改善缺铁性贫血I .1试验项目II .1动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 血红蛋白1.1.13 红细胞压积/红细胞内游离原吓咻1.1.14 体试食试验1.1.14.1 血红蛋白1.1.14.2 清铁蛋白1.1.14.3 细胞内游离原吓咻/血清运铁蛋白饱和度1.2 试验原则1.2.1 2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。1.2.2 针对儿童的人体试食试验，只测血红蛋白和红细胞内游离原吓咻。1.2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。1.3 结果判定1.3.1 动物实验：血红蛋白指标阳性，红细胞内游离原

2、叶咻/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血动物实验结果为阳性。1.3.2 人体试食试验.1针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原吓咻二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。1.3.2.2针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原叶咻/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。改善缺铁性贫血检验方法1动物实验1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。1.

3、2 实验动物健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠8-12只。1.3 低铁饲料配方：成分添加量g玉米淀粉529.5蛋清蛋白东200.0蔗糖100.0玉米油(无添加剂)70.0纤维素50.0混合矿物盐(AIN-93G-MX)35.0混合维生素(AlN-93G-VX)10.0L-胱氨酸3.0氯化胆碱2.5*亦可使用EDTA处理的酪蛋白AIN-93G混合矿物盐配方矿物质添加量gormg/kgmixCalciumcarbonateanhydrous357.00Potassiumphosphatemonobasic196.00Potassiumcitrate,tripotassiummonohydratc7

4、0.78Sodiumchloride74.00Potassiumsulfate46.60Magnesiumoxide24.00Zinccarbonate1.65Sodiummeta-siIicater9H2O1.45Manganouscarbonate0.63Cupriccarbonate0.30Chromiumpotassiumsulfatcri2H2O0.275Boricacid(17.5%B).mg81.50Sodiumfluoride(45.24%F),mg63.50Nickelcarbonate(45%Ni),mg31.801.ithiumchloride(1638%Li),mg17

5、.40Sodiumselenateanhydrous(41.79%Se),mg10.25AIN-93G混合维生素配方维生素添加量g/kgmixNicotinicacid3.000Capantothenate1.600Pyridoxine-HCl0.700Thiamin-HCl0.600Riboflavin0.600Folicacid0.200Biotin0.020VitaminB-12(cyanocobalamin)(0.1%inmannitol)2.500VitaminE(all-rac-a-tocophcrylacctatc)2(500IUg)15.000VitaminA(all-tran

6、s-retinylpalmilate)2(500,000IUg)0.800VitaminD-3(cholecalciferol)(400,000IUg)0.250VitaminK-I(phylloquinone)0.075Powderedsucrose974.6551.4 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳亚铁，ppmJc2mggBW,以Fe元素计）受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.5 实验步骤1.5.1 建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在实验环境下适应35天后

7、饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水）采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.30.5ml。实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb,如多数动物Hb低于Ioog/L时，测定全部大鼠的体重及Hb01.5.2 恢复实验选取HbVlOOg/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，测定体重及各项血液学指标。1.6 观察指标体重、血红蛋白、红细胞压积/红细胞内游离原口卜咻。1.6.1 血红蛋白

8、测定（IK化高铁法）消光系数法和标准曲线法任选其测定血红蛋白。在满足实验方案和仪器要求的前提下，也可采用血液分析仪测定。1.6.1.1 吸光系数法1.6.1.1.1 原理血红蛋白(haemoglobin,Hb)被铁新化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与就离子结合形成凯化高铁血红蛋白(红色)鼠化高铁血红蛋白(红色)极为稳定，在540nm波长下，摩尔吸光系数为44000,据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。1.6.1.1.2 仪器分光光度计。10微升微量吸管。1.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢钠(NaHCo3,AR)140ng铁银化钾200mg、氟化钾50mg,用水溶解并稀

9、释到IOoOmL。贮存于棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱(4C)保存，至少可稳定数月到1年。1.6.1.1.4 实验步骤1.6.1.1.4.1 取试剂2.5mL于5mL带盖试管中，加入10L血液，混匀后，放置15分钟。1.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于54Onm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以736,即为血红蛋白浓度(gL),计算公式如下：C=DMWX25164458=D54oX736t440000.5HiCNCt=待测的血红蛋白(gL)浓度。D徐二制化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。251=测定时血液的稀释倍数（血IOL加入试剂2.5mL中）44000=

10、制化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数0.5=比色杯的光径64458=血红蛋白的分子量1.6.1.1.5 注意事项1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因鼠离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等）否则将直接影响测定的结果。1.6.1.1.53仪器在使用前最好应以WHO规定的氟化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的制化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氧化高

11、铁血红蛋白标准液。1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理血红蛋白（hemoglobin,Hb）在铁制化钾和凯化钾的作用下生成极为稳定的辄化高铁血红蛋白（红色）其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。1.6.1.2.2 仪器10L血色素吸管（或定量毛细管）5mL或IOmL带盖试管分光光度计1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢钠（NaHCO3,AR）140mg铁辄化钾200mg、和七钾50mg,用蒸储水溶解并稀释到IooOmL,贮存于棕色试剂瓶内，保存于4冰

12、箱可稳定至1年。1.6.1.2.4 实验步骤吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10L血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10L放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15min0选用0.5Cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量（叽）计算参考物质的回收率。1.6.1.2.5 注意事项1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因乱离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的

13、含量，因为仪器的波长准确与否、仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）1.6.1.3 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算尸值，产值VR）.3，结论：各组均数间差异无显著性；尸值2R）05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照

14、组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到IOgZL以上，判定该实验结果阳性。1.6.2红细胞内游离原口卜琳测定1.6.2.1 原理血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原吓咻在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原口卜咻乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原吓咻（FreeerythroCyteproIoporphyrin,FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原口卜咻，在一定波长下测定其原吓咻的荧光强度而定量。1.6.

15、2.2 仪器162.2.1荧光分光光度计或930型荧光光度计。1.6.2.2.2离心机。1.6.2.2.3混旋器。1.6.2.3试剂1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL（ImL=500单位）1.6.2.3.2 5%（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL01.6.23.34:1乙酸乙酯和乙酸混合液。1.6.2.3.40.5NHC1-1.6.23.5原口卜咻标准液。1.6.2.3.5.1原吓咻标准贮备液（50mgL）称取5mg原口卜咻,加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5NHCI稀释至100mLo1.6.23.5.2原口卜咻标准中间液（LOmgZLJ取2mL原吓咻贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到IOomL。1.6.235.3原11卜咻标准应用液（0.1mgU取ImL原口卜咻中间液