最新染色体微阵列分析实验室技术要求专家共识.docx

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1、最新染色体微阵列分析实验室技术要求专家共识染色体微阵列分析(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA),是以微阵列为技术基础的基因组拷贝数变异(copynumbervariations,CNVs)分析技术,主要包括基于比较基因组杂交的微阵列(array-basedcomparativegenomichybridization,aCGH)和基于单核甘酸多态性的微阵列(singlenucleotidepolymorphismarray,SNParrayCMA是一种高分辨率的全基因组染色体变异检测技术，近年来其在临床的应用逐步深入和广泛，国内外已出台相关指南与专家共识以推动

2、其在临床的规范应用。为进一步规范染色体微阵列分析技术的临床应用，保证医疗质量与医疗安全，国家卫生健康委员会临床检验中心产前筛查与诊断室间质量评价专家委员会组织专家进行了充分讨论，拟在CMA实验室技术等方面作出规范和建议，以规范CMA技术在遗传病诊断领域中的应用。随着技术的更新与成熟，本共识将持续更新以满足临床需求。一、CMA医疗机构要求开展CMA技术,应在与其功能、任务相适应的医疗机构(根据产前诊断技术管理办法的有关规定经省级卫生行政部门许可开展产前诊断技术的医疗保健机构、三级医院)或国家相关部门认定的第三方医学检验机构中进行。检测机构应具备相应的医学实验室诊断技术平台、诊断技术资质和具有遗传

3、咨询资质的医务人员1。医疗机构应设有管理规范、运作正常的由医学、法学、伦理学等方面专家组成的CMA技术临床应用伦理委员二、染色体微阵列分析人员资质要求（一）遗传咨询人员需取得医师执业证书、执业范围为开展本技术应用的相关专业医师，有5年以上临床诊疗工作经验，具有主治医师及以上职称，必须符合从事产前诊断技术卫生专业技术人员的基本准入标准，具备系统、扎实的医学遗传学基础理论知识，对辅助诊断手段及实验室检测结果要能正确判断，并能对各种遗传的风险与再现风险作出恰当估计口。（二）实验技术人员需为检验医学等医学相关专业、大学专科及以上学历，具有一定的分子生物学知识及3年临床检验操作经历，熟练掌握相关仪器设备

4、的使用操作,具有临床基因扩增检验上岗资格证，符合母婴保健专项技术服务基本标准的有关规定，取得母婴保健技术考核合格证书,有经过CMA技术相关知识和技能培训并考核合格口23。（三）数据分析及报告审核人员数据分析人员需硕士及以上学历、报告审核人员需具有副高及以上职称,需具备与开展本技术应用相关的专业（妇产科、儿科、医学检验科、临床遗传学等）背景，掌握临床遗传学专业知识和技能，经过CMA技术系统培训并考核合格。最终报告须保经过报告审核人员的审核方可签发。（四）人员培训实验室应当有计划地对相关检测人员进行资格确认、培训、考核和监督,保持和提高检测人员的质量意识和技术水平以满足检测要求。实验室应当建立检测

5、人员的技术管理程序文件，保证培训、考核等管理活动的目的性和有效性。三、染色体微阵列分析实验室要求（一）实验室总体设计及要求CMA实验室的总体设计与要求应参考医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则（卫办医政发2010194号1基因芯片诊断技术管理规范（施行）进行2,3。实验室的安全保护设施与措施可参照实验室生物安全通用要求（GB19489-2008）和微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS233-2002）4,5。CMA实验需在临床基因扩增实验室中进行，实验室需满足临床基因扩增实验室建设规范。开展CMA项目的各机构实验室

6、应根据各省级临床检验中心要求，对实验室进行资质申报并通过或备案。（二）实验区域设置CMA检测需设置以下实验区域：试剂准备区（用于完成试剂分装及配制等操作）、标本制备区（完成标本基因组DNA提取、消化、连接及PCR前处理）、基因扩增区和产物分析区（主要完成PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、片段化、标记、杂交、洗脱、染色及芯片扫描），各区域配备相应的专用仪器设备。根据各机构实验室基础条件，可选择性设置CMA数据分析室（区）及相应的计算机软、硬件。此外实验室需具备标本保存和CMA相关试剂耗材贮存的基本条件23。四、染色体微阵列分析伦理与知情同意根据CMA检测内容、特点,经开展该项目机构的伦理委员会讨论和批

7、准，确定知情同意书的模板。在进行CMA检测之前,必须让患者签署纸质或在线版（网页/移动版）的知情同意书。知情同意书上需详细说明CMA的优点和局限性、检测的报告原则和报告阈值拷贝数变异（copynumbervariation,CNV）;单亲二倍体（uniparentaldisomy,UPD）;杂合性缺失（IOSSofheterozygosityzLOH）；低比例嵌合体等、可能存在检测失败的风险。极少数情况下，也有可能检测到胎儿父母与胎JL不存在生物学关系以及可能发生的经济和心理负担。五、染色体微阵列分析标本要求(一)标本类型CMA临床应用的范围广泛，其可检测的标本类型多样。应用于产前诊断,可根据

8、孕周大小，分别采集绒毛膜绒毛、羊水、羊水染色体核型培养的细胞悬液或贴壁羊水细胞、脐静脉血用于CMA检测；如需进行父母家系及先证者检测验证，则主要采集家系及先证者的外周血进行检测；应用于反复习惯性自然流产病因分析，主要采集流产绒毛、胎儿组织(皮肤、肌肉等)进行CMA检测；CMA检测实验室应对不同类型的标本有采集、处理和储存的标准操作文件，确保标本可以满足检测需要。(二)标本采集采集标本过程应严格按照卫生部微生物和生物医学实验室生物安全通用准则要求，做好生物防护，使用一次性无菌容器及消毒的手术器械以避免样品污染，同时保护实验人员的操作安全5。不同标本采集要求如下。1.血液标本：外周血和脐血标本的采

9、集，须注意抗凝剂的选择，一般CMA项目建议使用EDTA抗凝采血管，采样时轻轻颠倒混匀采血管数次，以确保血液充分抗凝，避免溶血和血凝块，采样量25ml,用于基因组DNA(genomicDNAzgDNA)提取,28下可保存35do绒毛采集,一次活检取样需20mg左右用于染色体核型分析（约Iomg）和CMA检测（约5mg）,取材后使用生理盐水进行充分洗涤，于显微镜下分离蜕膜和血凝块。大多数情况下，绒毛标本无需培养可直接进行gDNA提取。3 .羊水标本：羊水采集，一次抽取羊水量25-35ml,用于染色体核型分析（约20ml）和CMA检测（约IomII羊水采集时为避免母源污染,最初的12ml弃去并更换注

10、射器。羊水标本要求新鲜、清亮无浑浊、无胎粪、无凝块、无母血污染（血性羊水）,可疑母源污染的羊水标本需进行羊水细胞培养，待羊水细胞贴壁后，去除悬浮的红细胞，使用细胞刮或胰酶消化后取贴壁羊水细胞，生理盐水洗涤处理后，再用于gDNA提取。当羊水取材量不足以同时进行染色体核型分析和CMA检测时，可经过羊水细胞培养后，取传代细胞悬液或贴壁细胞,用于gDNA提取。4 .流产组织标本：流产组织包括胎儿肌肉、皮肤组织，要求新鲜取材，不能使用福尔马林、酒精、丙酮等固定液固定过的标本。取样量为IOmg左右，首先用生理盐水漂洗两次，然后剪碎/切碎组织并置于离心管中，加入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，用于gD

11、NA提取。5 .家系标本：涉及先证者检测及父母验证，建议家系标本的采集应在进行CMA检测的同一医疗机构完成，根据不同检测方法的需要选择对应的标本采集要求。（三）标本转运标本需注明唯一性编号（编码规则由各实验室制定）、患者姓名、检测目的和采样日期，如条件允许，建议尽快将标本转运至实验室进行预处理或保存。标本运送应符合相应的生物安全要求。当采样地点与检测实验室距离较短，标本可由专人在常温下运送，长距离运送需在28下保存通过医院专人或物流运抵实验室，并有标本递送接收登记记录表，核对标本标识的姓名与检测申请单、知情同意书是否一致。（四）标本信息采集与录入1 .临床信息采集：临床咨询医生需要充分采集患者

12、的临床症状、家族史等相关信息，便于数据分析人员对CMA结果进行数据分析及致病性判读。2 .临床信息再收集：数据分析人员综合多个数据库中已报道的病例相关临床信息，需要与临床咨询医生保持充分的沟通反馈，用于完善该标本的临床信息再收集。3 .标本相关信息包括但不限于以下内容：患者姓名、出生日期、性别、种族/民族、家族史（相关家系人员遗传病史检测项目、相关临床检查及结果、采集日期、唯一性标识（应考虑到同一家系不同患者间的联系标本类型、送检医院和医生信息等。采集标本时和实验操作前均应进行信息复核。信息录入需及时、准确无误。实验室建立信息化管理系统，用于标本信息的流转、实验流程规范、数据上传、报告审核及检

13、测报告的生成，实现CMA项目的信息化管理。（五）标本提取与保存实验室收到标本后，进行预处理并在合适的条件下短期储存。因不同标本类型提取的gDNA的性能特征可能不同，应根据不同的CMA平台对标本的要求，使用推荐的商品化基因组提取试剂盒进行gDNA提取。提取过程中，需做到标本的正确标注和对应，关键的转管操作，应使用双人复核,避免标本混淆。提取完成的gDNA标本，可在28OC下保存3d或在-70OC以下环境中长期保存。（六）标本的质量控制1 .内源和外源抑制物：CMA实验过程中,需要进行PCR扩增,某些临床特殊标本因涉及内源性（血红蛋白、乳铁蛋白、血红素及其代谢产物、尿素、离子、月旦盐、多糖等）和外

14、源性（手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物等）的PCR反应抑制物的存在,可能会出现PCR扩增抑制的现象，不能获得检测结果，这种情况并非CMA技术的缺点，而是由标本自身差异及外源因素导致。此时需要考虑其他不涉及PCR扩增的诊断技术进行检测或验证（如染色体核型技术、荧光原位杂交技术等2 .嵌合体：绒毛、羊水标本会存在嵌合体的情况，可能导致染色体核型结果与CMA检测结果不一致。产生这种结果差异的原因，一方面是绒毛标本可能存在限制性胎盘嵌合，另一方面是母源污染、羊水细胞自身畸变以及体外培养引起的细胞畸变等因素导致的假性嵌合体、嵌合比例降低或升高。目前只有具有SNP探针的CMA平台,方能检测低比

15、例嵌合体，其检测能力受SNP探针覆盖范围及探针密度的影响。3 .母源污染：产前诊断的绒毛、羊水和流产组织，存在母源污染的可能，标本进行细胞培养后，收获悬浮或贴壁的胎儿细胞，可用于CMA实验检测。脐血标本也有可能受到母源污染。短串联重复序列分析（shorttandemrepeats,STRs）可用于母源污染的鉴定。各实验室应根据情况，确定不影响CMA正常检测及结果分析的母源污染比例阈值。4 .不合格标本拒收标准：标本的验收是后续成功检测的关键。对拒收的标本需反馈拒收原因。以下情形的标本应拒收：（1）标本采集不当：标本量不足、未使用正确抗凝剂、标本存在溶血、凝血、标识不清、标本不新鲜（腐烂、发臭等

16、）等；（2）标本运输不当：标本运输温度不对、标本容器破损或开盖等；（3）标本gDNA浓度、纯度不佳；（4）检测申请单内容不完整,申请单与知情同意书信息不对应。对于标本量较少，能满足单次检测用量但不足以满足标本复测和留存时，可与临床科室、患者沟通后予以接收。六、染色体微阵列分析实验质量控制（一）技术平台及试剂要求CMA平台的主设备和试剂，均应优先选择中国食品药品监督管理总局认可的产品。不含有SNP检测位点的aCGH能够检测染色体非整倍体异常和染色体微小拷贝数变异,但不能检测单亲二倍体(uniparentaldisomy,UPD)、杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH平衡重排(易位、倒位三倍体和低比例的嵌合体6