单细胞测序技术在支气管肺发育不良中的研究进展2023.docx

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1、单细胞测序技术在支气管肺发育不良中的研究进展2023摘要支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasiazBPD)是一种慢性肺部疾病，主要发生在早产儿。单细胞测序技术有助于研究人员详细了解BPD相关基因分子表型及单个细胞在微环境中的具体作用。本文综述了单细胞测序技术在BPD中的研究进展。支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)是早产儿常见和严重的后遗症之一。我国胎龄25周及以下早产儿中BPD的发生率为74.2%胎龄2627周发生率为51.9%胎龄2829周发生率为33.4%,胎龄30-31周发生率为19.3%1o目前认为，BPD是在肺发

2、育晚期，肺泡和微血管形成缺陷导致气体交换障碍的慢性肺病,其病理特征包括气道损伤、肺泡间隔纤维化、肺泡简化和微血管畸形等。BPD不仅是肺损伤，还会发展为全身疾病，影响患儿的生活质量20近年来，随着单细胞测序技术的发展，已能在单个细胞水平上探究基因表达信息，并评估肺发育过程中复杂的细胞动力学。本文综述单细胞测序技术在BPD中的研究进展。一、单细胞测序技术单细胞测序技术是基于高通量测序方法，检测群体中的单细胞基因组、单细胞转录组、单细胞表观基因组及单细胞蛋白组，提供高分辨率的细胞间差异视图,包括单细胞转录组测序（single-cellRNAsequencing,scRNA-seq单细胞DNA测序、单

3、细胞DNA甲基组测序及单细胞T细胞受体测序等多种技术。单细胞测序流程大致包括单个细胞分离，核首酸扩增和测序，测序数据处理，数据处理主要包括质量控制、归一化、缺失值填充、特征选择及降维处理，最终寻找到疾病突变点，为治疗疾病提供思路3z40二、BPD肺组织单细胞图谱的变化单细胞图谱是基于单细胞测序技术，着重分析细胞种类、分子特征及其变化规律的一种方法，建立细胞与细胞间相互作用网络，用于研究疾病的发病机制和药物使用靶点51LU等6采用scRNA-seq技术对BPD患儿肺泡灌洗液中除红细胞外的20000个细胞构建单细胞文库，即互补DNA扩增后的大量片段，为绘制单细胞图谱提供依据，证实肺泡灌洗液中含有衍

4、生的间充质细胞系,该细胞系与BPD中描述的异常细胞外基质表达密切相关。同样，Taghizadeh等7采用scRNA-seq技术证实了肺泡上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞及巨噬细胞等在高氧状态下转录谱的可变性，为高氧触发炎症提供了依据。为预测BPD患儿的长期肺损伤情况，Scaffa等8使用scRNA-seq技术对BPD小鼠模型中32组细胞进行鉴定，得到全基因组的分子图谱，发现直至晚年，高氧所致细胞亚群种类的变化及肺部干细胞功能的丢失持续存在，使BPD患儿成年后肺部功能障碍与早期高氧肺损伤联系起来。随着单细胞测序技术的迅速发展,单细胞图谱将从单细胞水平为探索BPD细胞异质性及细胞生存微环境动态变化提

5、供更多借鉴及思路。三、单细胞测序技术在BPD研究中的应用(一)BPD发病机制的研究1 .肺细胞：受围生期各种因素的影响，肺血管和肺泡发育停滞较为明显，使远端肺腺泡发育简单化，导致发育重塑，最终形成BPDo因此，采用scRNA-seq技术识别BPD不同细胞亚群中的基因表达谱，揭示BPD形成过程中细胞群体的异质性，可以了解BPD中肺细胞的异质性及其相关的致病机制9L(1)肺内皮细胞：肺内皮细胞是高氧应激状态下最易受影响的细胞。为研究肺内皮细胞的基因特征，Zanini等10采用scRNA-seq技术和原位RNA成像技术对小鼠内皮细胞亚群进行分析，确定了不同细胞表型在肺损伤和血管损伤及重塑中的改变。V

6、ila日IiS等11使用SCRNA-Seq技术发现肺内皮细胞需要借助血管内皮生长因子NvascularendothelialgrowthfactorA,VEGFA)发挥作用，该物质主要由肺泡I型细胞产生，并且由碳酸酊酶4特异性标记为定位BPD损伤的内皮细胞提供了条件。(2)肺神经内分泌细胞(pulmonaryneuroendocrinecells,PNECs):PNECS是一种多功能上皮细胞，在感知缺氧、机械拉伸以及免疫反应等方面有重要作用120Noguchi等13对PNECS谱系进行scRNA-seq技术分析，证实PNECs中升高的蛙皮素样肽是诱导肺泡中肌成纤维细胞增殖并导致肺泡厚度增加的因

7、素之一，为BPD发病机制的精准研究提供了有力证据。(3)血小板衍生生长因子受体日性(platelet-derivedgrowthfactorreceptoralphapositivezPDGFR+)细胞:PDGFRa+细胞是一类可在肺泡发育过程中分泌营养因子且具有异质性的细胞群体。研究人员发现,死于BPD的早产儿肺部PDGFRa+细胞及肺泡II型细胞数量明显减少14o结合scRNA-seq技术对小鼠PDGFRa+细胞进行检测,发现PDGFRa+细胞条件性失活是BPD发生的诱因之一，提示PDGFRa+细胞可作为BPD的预测靶标150(4)免疫细胞：除气体交换外，肺还充当重要的免疫屏障。肺泡巨噬细

8、胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和树突状细胞等在肺的免疫过程中发挥重要作甩其中，肺泡巨噬细胞需要向成熟的抗炎细胞过渡，例如CD45.CD11c+.CD68+及MHC11+细胞亚型，该类亚型均被证实能在高氧状态下被激活，参与炎症过程并干扰肺泡发育16,17o上述发现为BPD发病机制的研究提供了新途径。在探究免疫细胞与炎症分子关系的研究中，Bhattacharya18睬用SCRNA-Seq分析72例BPD患儿夕卜周血CD8+T细胞转录图谱，发现TGFB、NRF2、HIPPO和CD40的相关受体基因丧失了部分活性，间接说明该类基因可预测BPD的发生。2 .细胞间信号通路：在肺发育过程中，细胞间信号通路对指

9、导肺泡化及血管化具有重要作用。Kugler等19对11000只小鼠肺脏细胞进行scRNA-seq分析发现Hedgehog(HH信号通路在细胞聚类后被抑制，使肺泡血管结构和内皮细胞基因表达发生不可逆改变，该过程奠定了BPD的发生基础。IkonomoU等20使用scRNA-seq技术来确定骨形态发生蛋白9（bonemorphogeneticproteins9,BMP9ACVRL1基因通路特征，发现抑制F0XF1基因转录因子可减少BMP9、ACVRL1的信号传导，可造成肺泡及肺血管生成障碍，从而导致BPD的发生。为研究肺泡细胞增殖及信号通路对BPD的诱导过程,Riemondy等21对BPD小鼠模型进

10、行scRNA-seq,发现TGF-B信号在发育停滞的肺泡上皮细胞中明显上调，在转分化细胞中相对下调，该发现阐述了BPD发生过程中肺泡再生或再生失败的原由，同时也为BPD的肺泡简化提供了相关分子机制。3 .其他：表观遗传机制、小分子RNA介导效应、性染色体及性腺激素的差异是男性患儿易患BPD的原因22o雄性激素会增加高氧状态下肺损伤，而雌性小鼠可能具有良好的抗氧化防御机制，能在高氧肺损伤中得到更好的保护23oCantu等24使用scRNA-seq分析肺发育不同阶段的35000个细胞，并制作相关基因转录谱，发现男性和女性反应性肺泡毛细血管与动脉内皮细胞的差异基因表达出现相应的上调或下调，且在不同性

11、别中上调与下调基因不一致。（二）BPD预防及治疗的研究采用有效的防治方案是降低BPD发病率及病死率的关键。产前应用糖皮质激素，产后减少气管插管及呼吸机的使用，应用肺表面活性物质、利尿剂、咖啡因、支气管扩张剂及维生素A等治疗已被证实可以改善BPD的症状及预后25,260近年来,基于单细胞测序技术的细胞疗法及蛋白质疗法也逐渐走入人们视野。1 .细胞疗法：间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有强大的抗炎特性，可诱导促炎性细胞因子向抗炎细胞因子转化，还能通过细胞间信号转导发挥修复损伤肺泡或血管的作用27oMizIkovA等28对正常小鼠和高氧暴露小鼠的肺MSCs进行sc

12、RNA-seq分析,发现高氧状态下MSCs的数量减少且基因表达也呈现降低趋势，其原因可能是在炎症信号的驱动下，免疫细胞及内皮细胞增加了多种促炎症、促纤维化和抗血管生成基因的表达，这为MSCs治疗BPD提供了依据。Ren等29在BPD小鼠模型中导入C-Kr+内皮细胞，并对该模型肺组织进行scRNA-seq分析,发现良性肺血管的生成较对照组增多，且损伤的肺泡细胞数量较对照组少。EIdredge等30在BPD患儿的肺泡灌洗液中鉴定出表达CD14+.CD16+和CD14.CD16-的单核细胞，发现单核细胞特异性表达的白细胞介素1可能与BPD的进展相关。以上发现提示临床中使用正常细胞替代受损细胞，可能减

13、轻早期肺损伤，为免疫细胞治疗BPD提供了理论依据。2 .蛋白质疗法：成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactorfFGF)是一组由垂体和下丘脑分泌的家族性结构相关蛋白多肽，与其受体构成了复杂的信号系统，在促进新生肺泡形成中起着关键作用。检测早产儿脐带血FGF-IO含量,研究者发现BPD早产儿的血清FGF-IO水平显著低于无BPD者310Taghizadeh等7采用scRNA-seq技术对高氧组及常氧组的小鼠肺细胞进行分析,证明注射FGF-Io能够在BPD小鼠模型中诱导新生肺泡的形成。FGF-10表达降低导致的囊状分支减少和气道末端周围的肌成纤维细胞定位异常均是BPD的组织学

14、特征。该发现为使用FGF-Io改善BPD的病理改变指引了新方向。高氧应激可诱导肺组织释放高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinB1,HMGB1)该物质被称为骨髓MSCs趋化因子。Hara翱32使用scRNA-seq技术探索HMGB1在BPD相关肺损伤细胞水平的变化情况，发现HMGB1可诱导内源性MSCs再生，从而抑制促炎细胞及促纤维细胞功能，改善BPD肺损伤。脂肪相关分化蛋白也会影响肺泡化过程，Khaghani等33对脂肪细胞分化相关蛋白谱系采用scRNA-seq技术鉴定出7个主要细胞簇，发现其主要覆盖肺发育后期的上皮细胞、间充质细胞和血管细胞群，可识别细胞亚群性

15、质，为靶向治疗BPD提供了更有利的证明。这将为BPD患儿的蛋白质疗法提供个体化指导方案。(三)单细胞测序技术在BPD相关并发症诊治中的应用爱帕琳肽是一种血管扩张剂和血管生成因子，具有减轻肺部炎症、纤维蛋白沉积和右心室肥厚等作用340Hackett等35采用scRNA-seq技术对高氧及炎症所致的BPD相关肺动脉高压小鼠模型的肺内皮细胞进行研究，证实爱帕琳肽在肺损伤时表达显著降低，为应用爱帕琳肽治疗BPD-PH提供了新思路。BPD不仅是ROP的危险因素，还会增加ROP的严重程度36o研究表明,缺氧诱导因子1o(hypoxia-induciblefactorzHIF-1)与新生血管增殖有关。Udd

16、in等37利用scRNA-seq技术证实HIF-I。在MRC-I+单核巨噬细胞、CD4+T细胞和CD19+B细胞中表达增强，并推断出特异性巨噬细胞mRNA可能是预测新生血管变化对治疗反应的有力证据。通过以上研究，证实了scRNA-seq技术在探索BPD并发症的演变过程中是非常有利的工具。四、小结和展望单细胞测序技术通过对单个细胞基因组的测量，可精准挖掘单个细胞中特异性基因，深入探讨相关调控机制，为BPD研究带来更加完善的理论基础，同时提供了有效观察疾病进展、治疗反应及预后的相关指标。scRNA-seq技术的发展促进了单细胞转录组的研究,细胞捕获、表型分析、分子生物学和生物信息学水平的快速发展，是单细胞测序技术广泛应用的前提条件。但是单细胞测序技术仍然存在样本杂质含量高、全基因组扩增难、转录样本丢失、扩增效率不同、数据的处理等问题