YMDD突变检测.ppt

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1、拉米夫定拉米夫定(Lamivudine)硫代脱氧胞嘧啶硫代脱氧胞嘧啶（2-deoxy-3-thiacytidine，3TC）核苷类似物核苷类似物口服抗病毒药物口服抗病毒药物英国葛兰素威康制药公司推出的英国葛兰素威康制药公司推出的贺普丁贺普丁(heptodin)在在2000年已被国家药品监督管年已被国家药品监督管理局批准列入国家基本药物制剂品种目录，理局批准列入国家基本药物制剂品种目录，1998年被年被FDA批准用于临床。批准用于临床。拉米夫定的作用拉米夫定的作用竞争性阻断逆转录酶（依赖竞争性阻断逆转录酶（依赖RNA的的DNA多聚酶）活性，有效地抑制多聚酶）活性，有效地抑制HBV的复制的复制进入

2、细胞的拉米夫定在激酶的作用下可进入细胞的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化为三磷酸脱氧胞苷，可以与被磷酸化为三磷酸脱氧胞苷，可以与dCTP竞争性掺入延伸的竞争性掺入延伸的DNA，因它缺，因它缺乏乏3羟基而使复制的病毒羟基而使复制的病毒DNA链终止。链终止。为什么在使用为什么在使用拉米夫定拉米夫定(Lamivudine)(Lamivudine)要进行要进行YMDDYMDD检测检测?拉米夫定治疗拉米夫定治疗HBVHBV感染感染治疗过程与治疗过程与YMDDYMDD变异关系变异关系引自引自J Virol.Metods 1999；83：181-187治疗过程治疗过程研究例研究例数（例）数（例）无变异无变异

3、（YMDD）变异变异 YVDD、YIDD 治疗前治疗前139106（76%）33（24%）20(15%)13(9%)治疗治疗9个月个月3733（89%）4（11%）2(5.5%)、2(5.5%)治疗治疗12个月个月3725（67.5%）12（32.4%）7(19%)、5(13.5%)治疗治疗18个月个月167（43.7%）9（56.3%）7(43.7%)、2(12.5%)治疗治疗24个月个月124（33.3%）8（66.7%）4(33.3%)、4(33.3%)YMDDYMDD变异的耐药机制变异的耐药机制第第552552位的蛋氨酸（位的蛋氨酸（M M）被缬氨酸（）被缬氨酸（V V）或异亮氨酸（或

4、异亮氨酸（I I）替代后，使此侧链缩）替代后，使此侧链缩短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶结合而导致耐药。结合而导致耐药。变异株对拉米夫啶的敏感性大大降低。变异株对拉米夫啶的敏感性大大降低。体外实验证实该药物抑制变异株体外实验证实该药物抑制变异株HBVHBV复复制的效率可降为对野生株的万分之一。制的效率可降为对野生株的万分之一。YMDDYMDD突变突变Met-ATGYMDDVal-GTGYVDDYVDDIle-ATTYIDDYMDD编码DNA多聚酶（CODON552）YMDD 野生株：野生株：Tyrosine-Methionine-Aspartate-Aspa

5、rtate（YMDD）（）（酪氨酸酪氨酸）-（蛋氨酸（蛋氨酸）-（天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（天门氡氨酸天门氡氨酸）变异株变异株1：Tyrosine-Valine-Aspartate-Aspartate（YVDD）（酪氨酸酪氨酸）-（缬氨酸（缬氨酸）-（天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（天门氡氨酸天门氡氨酸）变异株变异株2：Tyrosine-Isole-Aspartate-Aspartate（YIDD）（）（酪氨酸酪氨酸）-（异亮氨酸（异亮氨酸）-（天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（天门氡氨酸天门氡氨酸）YMDD变异检测方法有：变异检测方法有：1、测序、测序：金标准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂：金标

6、准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂2、基因芯片、基因芯片：技术目前尚未成熟，仍需进一步研究：技术目前尚未成熟，仍需进一步研究3、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性：目前临床用得最多的是：目前临床用得最多的是RFLP，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化，出现新的酶切位点或原有的酶切酶切位点的变化，出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致检测失败。而且位点消失，导致检测失败。而且RFLP完全依靠凝胶电泳完全依靠凝胶电泳来判断结果，敏感性较差，假阴性率较高。该法对来判断结果，敏感性较差，假阴性率较高。

7、该法对HBV混合型耐药株感染显得束手无策混合型耐药株感染显得束手无策4、荧光定量、荧光定量real-time PCR：该技术为核酸的检测提供了新：该技术为核酸的检测提供了新的技术手段的技术手段YMDD突变检测常见方法1.基因测序法（标准的参考方法）基因测序法（标准的参考方法）2.荧光定量荧光定量PCR方法（实用的方法）方法（实用的方法）基于我国医疗机构实验室开展实时荧基于我国医疗机构实验室开展实时荧光光PCR检测十分普遍，这些实验室都拥检测十分普遍，这些实验室都拥有荧光定量有荧光定量PCR分析仪。故此，建立了分析仪。故此，建立了一种新的适应这类设备的实时荧光一种新的适应这类设备的实时荧光PCR

8、方法，应该符合中国的国情。方法，应该符合中国的国情。荧光定量PCR检测YMDD基本原理：确定探针特定的TM值来区 分是否突变。常用方法：覆盖突变位点荧光双探针杂交的方 法检测YMDD。TM值：在核酸加热变性过程中，当双链DNA 解链到一 半时所对应的温度就是该核 酸的TM值，也叫核酸的熔点。每种不 同的核酸有不同的TM值(特征常数特征常数)。影响TM值的主要因素1.碱基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的长度，核酸越长，TM越大。3.完全配对比不完全配对时TM值要大。溶解曲线分析（溶解曲线分析（TmTm）YMDD+YIDDYMDD+YIDD加热核酸时荧光强度变化曲线，当荧光陡变为0时所对

9、应的温度就是TM值。同样的核酸序列不同浓度TM值相同不同核酸TM值不同YVDDYMDDYIDDYMDD突变的熔解曲线检测原理YMDD：TM值显示54.64CYIDD：TM值显示46.91CYVDD：TM值显示50.74C46.91C 54.64C 50.74CYIDD YMDD YVDD临床资料临床资料标本标本 2005年年9月月-2006年年12月来省立医院感染科就诊的慢性乙月来省立医院感染科就诊的慢性乙肝患者肝患者187例，接受拉米夫定用药例，接受拉米夫定用药20天天-36个月，年龄个月，年龄12-66岁，岁，男性男性110人，女性人，女性77人。其中人。其中HBV-DNA 103 C0P

10、IES/ML157例，例，HBV-DNA含量为含量为 2.0103-8.0108 C0PIES/ML，HBV-DNA 103 C0PIES/ML 30例。例。试剂试剂 乙肝病毒核酸荧光乙肝病毒核酸荧光PCR检测试剂购置中山大学达安基因检测试剂购置中山大学达安基因股份有限公司，荧光股份有限公司，荧光PCR检测通用试剂和检测通用试剂和HBV-DNA提取试剂提取试剂由上海复星医学科技发展有限公司提供，引物及探针由上海由上海复星医学科技发展有限公司提供，引物及探针由上海百曼生物技术有限公司合成。百曼生物技术有限公司合成。突变类型突变类型相 符 例相 符 例数数不相符例不相符例数数突 变 的 含突 变

11、的 含量（量（%）H B V-D VA 含 量含 量（Copies/ml）YMDD23108.0103-6.0108YIDD21010.9-1009.0103-5.0108YVDD17011.42-1008.0104-7.5108YIDD/YVDD7011.18-1002.0105-6.1108合计合计681 项目开展情况项目开展情况ATG:rtM204（正常）（正常）GTG:rtM204（V变异）变异）ATT:rtM204（I变异）变异）ATT/GTG:rtM204(I/V双杂合子峰双杂合子峰)我们用实时荧光定量我们用实时荧光定量PCR方法检测方法检测187例临床乙肝患者血清标本，观察例临床乙肝患者血清标本，观察HBV的的YMDD变异情况，同时用测序法变异情况，同时用测序法作为金标准比对验证。作为金标准比对验证。结果表明，此方法在临床结果表明，此方法在临床YMDD变异变异诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。结结 论论