农业行业标准.docx

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1、农业行业标准乳及乳制品中（X-乳白蛋白和乳球蛋白的测定液相色谱法（征求意见稿）编制说明中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）内蒙古智慧质量中心有限公司黑龙江飞鹤乳业有限公司一、工作简况（一）任务来源2018年10月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所完成了乳及乳制品中-乳白蛋白和-乳球蛋白的测定液相色谱法标准草案和项目建议书等书面材料，向全国畜牧业标准化技术委员会提出申报。2019年6月，农业农村部发布关于下达2019年农业国家、行业标准制定和修订项目任务的通知（农质标函（2019）77号）批准项目立项，项目

2、计划编号：农质标函（2019）77号2019-20,标准起草单位为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，协助单位包括农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、内蒙古智慧质量中心有限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司。（一）制定背景牛奶是人们饮食结构中十分重要的食品，具备较高的营养价值,被认为是最完美的天然食品之一，在预防各种慢性疾病，促进人体各项机能成长等方面有着显著功效。乳蛋白是牛奶中主要的营养物质，它的含量是衡量牛奶营养价值高低的重要指标之一。a-乳白蛋白和0-乳球蛋白为牛奶乳清蛋白中重要的组分，具有较高的营养价值及功能特性。研究显示，a-乳白

3、蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，具有调节蛋白质平衡，促进免疫系统发育的作用。a-乳白蛋白与锌离子结合可以激活免疫因子，减少腹泻。此外，a-乳白蛋白富含的色氨酸是神经发育的重要因子，能够显著改善婴幼儿的睡眠质量。P-乳球蛋白能够与脂溶性维生素结合，从而促进他们的吸收；B-乳球蛋白有抗高血压、抗病毒、有助于钙、矿物质吸收等功能特性，已经被越来越多地应用于乳制品、婴幼儿配方食品中。-乳白蛋白和B-乳球蛋白是乳制品质量评判的重要指标之一。目前，国内外均无奶及奶制品中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测方法标准，建立高灵敏检测方法一直是制约奶业高质量发展的关键技术难题之一，迫在眉睫。（三）起草过程第

4、一阶段：起草阶段1）成立起草组在接到标准制定任务后，2019年6月成立了标准起草组，包括XXX共Il人（见表1）o2019年7月，标准起草组围绕a-乳白蛋白、P-乳球蛋白的检测技术等方面，制定了详细的实施方案和技术路线。*标准起草组成员及分工序号姓名单位分工1XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所整体方案设计，组织协调2XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所标准征求意见、方法验证3XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、标准文本撰写。4XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、材料完善5XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、材料完善6XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究

5、所材料检查修改7XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改8XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改9XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改10XXX内蒙古智慧质量中心有限公司方法验证JlXXX黑龙江飞鹤乳业有限公司方法验证2）收集和分析相关参考文献2019年6月到12月，收集到如下国内外相关法律法规、标准、书和文章，为标准起草提供了参考。37 JacksonJ.G,etal.Amultinationalstudyofa-lactalbuminconcentrationsinhumanmilk.JNuiriBiochem,2004,15(9):517-521.38

6、 YipingR,ZhengH,XiaojunC,JingshunZ,ZengxuanC,YongjiangW.Simultaneousdeterminationofbovinea-lactalbuminand-lactoglobulinininfantformulaebyultra-high-performanceliquidchromatography-massspectrometry.AnalyticaChimActa,2010,667:96-102.39 DingX,etal.Analysisofa-lactalbumin,-lactoglobulinAandBinwheyprotei

7、npowder,colostrum,rawmilk,andinfantformulabyCEandLC.DairyScience&Technology,2011,912:213-225.40 StandardizationIDF,Liquidmilk.Determinationofacidsolubleb-lactoglobulincontent.Reverse-phaseHPLCmethod.2005.41 DEWC,etal.Bioactivityof-lactoglobulinanda-lactalbuminTechnologicalimplicationsforprocessing.I

8、nterDairyJ,2006,1611:1229-1240.42 MeixiaChen,etal.DeterminationofnativelactoferrininmilkbyHPLConHiTrapTMHeparinHPcolumn.FoodAnalMethods,2019,12(11):2518-2526.由于本文件涉及的内容在奶业发达国家已经具有成熟的研究基础，考虑到我国奶业发展现状以及与国际奶业发达国家有效接轨，标准起草组首先查阅了以上相关参考文献，认为参考文献中关于a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测对起草本标准具有参考或是引用价值。3）实验工作，方法建立标准起草组在广泛查阅收集国内

9、外相关技术资料和标准基础上，拟定了样品前处理方法和仪器检测条件等初步实验方案，开展了乳及乳制品中-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测技术研究。本方法主要围绕生乳、巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、灭菌乳和乳粉中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测，从色谱柱的选择、检测波长的选择、前处理方法的确定、调PH后静置时间的确定、方法选择性、方法线性范围、标准溶液保存稳定性、方法定量限、方法准确度与精密度、实际样品的测定等多个方面对反相液相色谱法和凝胶渗透色谱法进行了优化实验和验证实验。4）试验验证情况2022年5月委托农业农村部乳品质量监督检验测试中心（北京）、农业农村部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨）和唐山市农产品质

10、量安全检验检测中心三家检测机构对标准方法的检测灵敏度、检测限、重复性、重现性、检测范围进行复核验证实验。验证结果表明，该方法设计合理，实用有效。5）形成标准征求意见稿在以上收集和分析相关参考文献，调研、试验验证工作的基础上，起草组按照标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则（GB/T1.12020）和标准编写规则第4部分：试验方法标准（GB/T20001.42015）的规定起草编写文本和编制说明，并组织开展4次专家讨论会。2020年6月150,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所组织召开视频研讨会，王加启、郑楠、张养东、刘慧敏、叶巧燕等104生产企业3收到20家单位及专家回函，共有160

11、条意见。经过研究和甄别,采纳64条意见，不采纳85条意见，部分采纳11条意见，并经过对征求意见稿进行修改完善，形成标准预审稿。第三阶段：预审阶段2023年3月31日，标准起草组组织召开了标准预审会，邀请李俊玲、陈义强、邓立刚、李宏、郑小平、刘壮、陶大力、靳婷婷8位专家，对标准预审稿进行了认真审查。在听取标准起草组汇报的基础上，专家组审查了标准文本及编制说明，提出如下修改意见:一是建议将标准名称修改为牛乳及其制品中-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定高效液相色谱法；二是范围添加“注：本文件仅适用于未变性的a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定；三是第一法标准曲线中增加lmgL的最低浓度点；四是编制说明中补充

12、两个方法提取步骤中“定容前后pH变化的相关数据和实际样品测定数据，以及生乳中B-乳球蛋白本方法与NY/T1663-2008的检测结果比较情况;六是按GB/T1.1和GB/T20001.4的要求进一步规范标准文本。专家组一致同意审查通过，建议标准起草单位按照上述意见进一步修改后形成牛乳及其制品中a-乳白蛋白和-乳球蛋白的测定高效液相色谱法(公开征求意见稿)，报全国畜牧业标准化技术委员会秘书处。预审意见汇总处理表附后。二、标准编制原则、主要内容及其确定依据(一)标准编制原则本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草，同时遵循以下原则：(1)政策性：

13、制定本文件直接关系到国家和广大人民群众的利益。因此，在制定过程中严格贯彻国家有关方针、政策、法规和规章。(2)先进性：对本文件中有关内容的确定，力求反映本研究领域的国内外先进技术和经验，使标准中所规定的技术内容有利于-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定。(3)规范性：在本文件征求意见稿的编制过程中力求做到技术内容的叙述正确无误，文字表达准确和简明易懂，标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑。(4)可操作性：可操作性是制定标准的必备因素，因此，在制定标准的过程中，始终把经济实用和可操作性作为重要的依据，以便在执行中容易操作。(二)主要内容及其确定依据1、反相液相色谱法M色谱柱的选择试验选取X

14、BridgeC18和XBridgeBEH300AC4色谱柱比较对浓度为100mg/L的IgG、BSA、乳铁蛋白、a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的分离效果。如错误!未找到引用源。所示，a-乳白蛋白和P-乳球蛋白标品在XBridgeBEH300AC4色谱柱上能与IgG、BSA和乳铁蛋白较好的分离且峰型尖锐对称，故选择XBridgeBEH300AC4色谱柱。图2-乳白蛋白和IJ-乳球蛋白等在XBridgeC18色谱柱上的色谱图1.2检测波长的选择不同文献中有报道利用液相色谱法对-乳白蛋白和-乳球蛋白进行检测，采用的检测波长有21Onm及280nm,为了选择待测物的最大吸收波长，本试验比较了上述不同波长下

15、-乳白蛋白和-乳球蛋白检测的色谱图（错误!未找到引用源。）。由图可知，a-乳白蛋白和B-乳球蛋白在210nm时进行检测，峰面积更高，且基线比较平稳，因此本试验采用210nm作为后续-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测波长。图3不同检测波长下a-乳白蛋白和A乳球蛋白典型色谱图(100mgZL)1.3前处理方法的确定牛乳中除了含有乳清蛋白外还含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能会对a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测产生干扰。因此要选择优化适当的前处理方法沉淀去除酪蛋白，以便更充分有效地提取未变性的a-乳白蛋白和B-乳球蛋白。本方法制定过程中比较两种前处理方法：方法一：取5.0g试样，加入水定容至25mL后离心，取中间层试液直接上机检测。方法二：取5.0g试样，加入水定容至25mL,用乙酸调节PH至4.60,静置后离心，取上清液上机检测。如错误!未找到引用源。可见，经方法二调节PH处理后,生牛乳和巴氏杀菌牛乳中未变性的a-乳白蛋白和供乳球蛋白保留在上清液中，经上机检测，两种蛋白分离的峰型较好、基线平稳且出峰时无干扰，故选择此方法为生牛乳和巴氏杀菌牛乳前处理方法，且本方法仅适用于未