过氧化氢含量H2O2试剂盒说明书.docx

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1、过氧化氢含（H2O2）试剂盒说明书微法M096样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定刑定意义，HzCh是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和PoD等催化降解。MCh不仅是垂要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽.一方面，HAh可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋臼质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体：另一方面HXh也是许多氧化应急反应中的关键调节因子,。刑定原理：H2O2与硫酸钛生成黄色的过化钛复合物，在415nm有特征吸收。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔

2、板、丙酮100mL,浓盐酸5mL、研钵和冰.试剂的组成和配制：试剂一：丙酮IoOmLXl瓶，4保存：（自备）试剂二：粉剂Xl瓶，4保存：临用前加入3mL浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4。C保存；（溶解时间较长，约30min,可40C-60,C加热，务必提前准备）试剂三：液体IOmLxl瓶，4保存；试剂四：液体30mLxl瓶，4保存；HzCh提取：1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：试剂一体枳（mL）为5001000:1的比例（建议500万细茜或细胞加入ImL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔

3、IOs,垂复30次）；用试剂一定容至ImL；800（亚4p离心10min,取上清，置冰上待测。2.组织样品的制备：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆；转移至EP管中，用试剂一定容至ImL,8000g4寸离心IOmin,取上清，置冰上待测.3、血清（浆）样品：直接检测.JM定步事：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至415nm,蒸情水调零。2、将试剂二、三和四37*C（哺乳动物）或25寸（其它物种）水浴IOmin以上。3、在EP管中按顺序加入下列试剂试剂名称（L）测定对照样本250试剂i250试剂二25

4、25试剂三50504000g.251C离心IOmin,弃上清，留沉淀试剂四250250加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min,取200L转移至微量有英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值A。对照管只要做一次即可。计算AA=A测定-A对照.注意事项：1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，清带一次性手套和口罩。HXh含量计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1,标准条件下测定的回归曲线，y=0.7488x+0.()006(X为标准品浓度，molmL:y为AA)。2、血清(浆)中Hxh含量的计算：FhCh含量molmL)=(A-0

5、.0()()6)O.7488=1.34(A-0.()6)3、细菌、细胞或动物组织中出6含量计算1)按照蛋白浓度计算H2O2含量(molmgprot)=(AA-0.0(X)6)0.7488V1(V1Cpr)=1.34(A-0.(X)06)Cpr需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。2)按照样本质量计算H2O2含量(molg鲜重尸(A-0.0(M)6)O.7488V1(WV1V2)=1.34(A-0.(K)06)W(3)按照细菌或细胞密度计算：H2O2含量Xmol104)=(A-0.0006)O.7488V1(500xV1V2)=0.0027(A-0.0006)VI：加入反应体系

6、中样本体积，0.25mL：V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL:W：样本质量，gi500：细胞或细菌总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、标准条件下测定的回也曲线，y=0.3744x+0.06(X为标准品浓度，molmL:y为AA)。2、血清(浆)中HQ2含量的计算：HXh含量(molmL)=(A-0.0006)0.3744=2.67(A-0.0006)3、细菌、细胞或组织中HzO2含量计算(1)按照蛋白浓度计算H2O2含量(molmgprot)=(A-0.0006)0.3744V11(V1Cpr)=2.67(A-0.06)Cpr需要另外测定，建议使用

7、本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。2)按照样本质量计算H2O2含量(molg鲜重)=(A-0.0006)O.3744V1(WV1V2)=2.67(A-0.0006)W(3)按照细菌或细胞密度计算：H2O2含量(mol104)=(A-0.0006)O.3744V11(500V1V2)=0.0054(A-0.06)Vh加入反应体系中样本体积，0.25mL：V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL：W：样本质量，g：500：细胞或细菌总数，500万。注意：标曲线性范围为0.1molmL-2mol/mL,吸光度AA线性范国为0.03-1,若AA超过1则需要稀释,计算公式乘以相应稀释倍数.