糖原磷酸化酶bGlycogenphosphorylasebGPb试剂盒说明书.docx

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1、糖原磷酸化酶b(GlycogenphosphorylaseblGPb)试剂盒说明书微法100管/48样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：糖原磷酸化酶(GIyCOgenphosphorylase,GP,EC2.4.1.1)是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开-l,4.糖苜键移去葡萄糖基，释放磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子l,6-糖背键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化前a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺甘酸(51-AMP)存在下可被激活。渊定原理：GP催化糖原和无机磷产生前萄糖残基生成糖原和I

2、-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH,在34Onm下测定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定浓度的腺甘酸(5-AMP)时测定GP(GPa和GPb)活性，未添加腺甘酸(5-AMP)时测定GPa活性，GP活性一GPa活性得到GPb活性。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：提取液：10OmLXl瓶，4保存；试剂一：液体16mLxl瓶，4C保存；试剂二：粉剂Xl瓶，20保存；试剂三：粉剂Xl支，209保存；试剂四：粉剂Xl支，-20*C保存：

3、试剂五：粉剂Xl支，-20C保存：样本的前处理：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g4C离心IOmin,取上清，置冰上待测。渊定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零：2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用：用不完的试剂分装后20C保存，禁止反复冻融。3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入ImL蒸储水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融。4、试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入ImL蒸偏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-

4、20C保存，禁止反复冻融。5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入500UL蒸储水充分溶解待用：用不完的试剂分装后-20C保6、存，禁止反复冻融。7、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37C预热5分钟；8、在微量石英比色皿或96孔板中加入10L样本、10L试剂三、10L试剂四、IOUL蒸谣水和160UL工作液，立即混匀，记录34Onm处5min后的Al和Iomin后的吸光值A2,计算AAGPa=A2-AL9、在微量石英比色皿或96孔板中加入10L样本、10L试剂三、10L试剂四、IOuL试剂五和160UL工作液，立即混匀，记录34Onm处5min后的A3和IOmin后的吸光值A4,计算AAG

5、P=A4-A30注意；由于每个样本需要同时测一个GP(GPa和GPb)活性和一个GPa活性，因此本试剂盒100管测48个样本。GPb活性计*a.用微石英比色皿测定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmolminmgprot)=(AGP-AGPa)VJ(d)109(V样XCPr)T=643(AGP-AGPa)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmol/min/g鲜重)=(AAGP-AAGPa)XV反总(d)109(WXV样V样总)T=64

6、3x(AAGP-AGPa)WV反总:反应体系总体积，210-4L;:NADPH摩尔消光系数，6.22103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL：W：样本质量，gob.用96孔板渊定的计算公式如下：(1)按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmol/min/mgprot)=(AGP-AGPa)V反总(d)109(V样XCPr)T=1286(AGP-AGPa)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmol/min/g鲜重)=(AAGP-AAGPa)XV反总(d)xl()9(WxV样V样总)T=1286x(AAGP-AGPa)WV反总:反应体系总体积,2104L；:NADPH摩尔消光系数，6.22103LZmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL：W：样本质量，go