体外分析技术核医学.ppt

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1、体外分析技术体外分析技术定义定义以放射核素标记（或其他非放射性标记）的以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。活性物质的检测技术。体外分析技术是结合了放射性核素的高体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便密度好、应用面广、方法简便等优点。等优点。方法

2、学基础方法学基础结合反应结合反应遵守可逆反应的质量作用定律：遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1R+L RL k2,v2定量手段定量手段放射性测量技术放射性测量技术酶定量技术酶定量技术化学发光定量技术化学发光定量技术生物学基础生物学基础：特异性结合反应：特异性结合反应：抗原抗原-抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；配基配基-受体的结合反应；受体的结合反应；底物底物-催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；结合体对：结合体对：抗原抗原-抗体抗体激素激素-激素结合球蛋白激素结合球蛋白受体受体-配体配体体体外外分分析析技技术术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放

3、射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析Dr.Yalow 在体外条件下在体外条件下,利用利用Ag与定量的与定量的*Ag对限量的特异性对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量量的一种超微量分析技术。的一种超微量分析技术。一、基本原理一、基本原理 Ag-Ab +Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab +*Ag(B)(F)4*Ag与与Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*AgAg AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg *Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag 90%2）半衰期足够长）半衰期足够长

4、3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3H or 125I3、非标记抗原、非标记抗原 （标准品）（标准品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度高纯度 B和和F的分离的分离1、第一类、第一类2、第二类、第二类双抗体沉淀法双抗体沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相第二抗体法固相第二抗体法二、基本方法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可溶性复合物可沉淀复合物可沉淀复合物试管试管试管试管分离方法的要求分离方法的要求分离完全、快速。分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不影响免疫反应的平衡，

5、即是要求在分离过程中不使抗原不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、受环境因素（温度、PH值等）的影响小。值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。三、质量控制三、质量控制（quality controlquality control）1、精密度（、精密度（precision）变异系数（变异系数（CV）7%10%2、准确度（、准确度（accuracy）回收率回收率=测定值测定值/真实值真实值100%90%110%3、灵敏度、灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量方法的最小可测量4、特异性（、特异

6、性（specificity）交叉反应率交叉反应率5、可靠性（、可靠性（validity）平行性试验平行性试验6、稳定性（、稳定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC 质量控制就是使用合适的方法以检查、质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。并使这种误差降低到某一允许水平。具体作用有：具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。识别误差的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质

7、量。改进测定方法的设计以提高质量。RIA RIA 小小 结结1.灵敏度高灵敏度高2.特异性好特异性好3.精确的定量精确的定量4.方法操作简便方法操作简便第二节第二节 免疫放射分析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab +*Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B%Ag（B）（F）在体外在体外,利用利用Ag与过量的与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。量。标记抗体，抗体是过量的。IRMA与与RIA工作原理的主要区别工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体

8、结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素B%B%拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的标准曲线拟合的拟合的NSBIRMA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线RIA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线RIA+或或01IRMA+1非放射性标记免疫分析技非放射性标记免疫分析

9、技术术酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术 ：用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISAELISA）。）。是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。感性的检测技术。ELISAELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMAIRMA相似的夹心法免疫反应，反

10、应结束后分离结合部分相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。正比。常用的酶是常用的酶是辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶，底物是，底物是四甲基联苯四甲基联苯胺胺 (TMB)(TMB)，反应后显黄色。，反应后显黄色。二、化学发光免疫分析技术：二、化学发光免疫分析技术：化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代化学发光免疫分析技术是以化学

11、发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。光子的物质。1 1、化学发光免疫分析：、化学发光免疫分析：是用化学发光物质作为标记物，标记抗原是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。测光子的数量就可以反映

12、复合物的量。常用的化学发光物质是常用的化学发光物质是异鲁米那异鲁米那和和吖啶酯吖啶酯。2 2、化学发光酶免疫分析：、化学发光酶免疫分析：和和ELISAELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物于特殊的底物-金刚烷金刚烷，使底物发射出光子。，使底物发射出光子。此法光子发射持续时间较长，可靠性比此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。较好。3 3、电化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析(略略)4 4、生物发光免疫分析、生物发光免疫分析(略略)三、三、时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免

13、疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）镧系元素共有镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 钐（钐（Sm），铕（），铕（Eu），镝（），镝（Dy），鋱（），鋱（Te）镧系元素荧光重要特点：镧系元素荧光重要特点：1、极长的荧光衰退时间、极长的荧光衰退时间 铕：铕：730000ns，钐：，钐：50000ns，一般荧光物质：，一般荧光物质：10ns 2、200nm的的Stokes位移位移 铕：激发光铕：激发光340nm，发射光，发射光613nm 荧光素的荧光素的Stokes位移为位移为273nm 3、狭窄的发射

14、峰、狭窄的发射峰 4、解离、解离-增强技术可使其荧光性提高增强技术可使其荧光性提高100万倍万倍时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）一、基本原一、基本原理理镧系元素（镧系元素（1515）：铕（）：铕（EuEu），钐），钐（SmSm），镝（），镝（DyDy），鋱（），鋱（TeTe）Eu+EuEu+增强液增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析”时间分辨荧光检测的基本原理示意图时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间荧光衰退时间铕：铕：730000 ns钐：钐：50000 ns一般荧光物质：一般

15、荧光物质：10 ns铕的荧光铕的荧光二、二、TrFIATrFIA的特点的特点1、最大限度提高测量方法的灵敏度、最大限度提高测量方法的灵敏度2、有与、有与RIA相似的特异性和精密度相似的特异性和精密度3、可同时测定两种以上的抗原、可同时测定两种以上的抗原4、无辐射污染、无辐射污染技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨波长分辨波长分辨将特异性荧光与非特异性荧将特异性荧光与非特异性荧光分离开光分离开零背景零背景高特异性高特异性解离解离-增强增强荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围更宽线性范围更宽重复性更好重复性更好低分子量原子低分子量原子标记标记标记位点

16、多可达标记位点多可达20个个对标记物的结构与活性影响对标记物的结构与活性影响小小无衰变无衰变受环境影响小受环境影响小灵敏度更高灵敏度更高高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标同一批次只需两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记一个试剂盒可同时测多一个试剂盒可同时测多个项目个项目总结总结：体外分析的发展体外分析的发展方法设计的改变：竞争结合分析方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变：放射性核素标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、荧光、酶、化学发光、稀土元素化学发光、稀土元素结合体的改变结合体的改变 微生物微生物 RMARMA 酶酶 REAREA 受体受体 RRARRA 特异结合蛋白特异结合蛋白 CPBA CPBA 改变结合体对改变结合体对放射性技术放射性技术 Ag Ag Ag-AbAg-Ab RIA +Ab RIA +Ab免疫学技术免疫学技术 AgAg Ag-AbAg-Ab 改变标记物改变标记物第一阶段第