重组水通道蛋白9对非酒精性脂肪肝病细胞模型的作用.docx

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1、重组水通道蛋白9对非酒精性脂肪肝病细胞模型的作用王川，袁媛，姜政，王丕龙(400016重庆，重庆医科大学附属第一医院消化内科)摘要I目的 构建人水通道蛋白9(叫UaglyCerOPorin9,AQP9)重组质粒，验证其在L-02肝细胞中的表达，并检测其对非酒 精性脂肪肝病(nonalcoholic fally liver disease, NAFLD)细胞模型的作用。方法 从人肝脏组织中提取总RNA, RT-PCR获得AQP9 基因，克隆到载体PEGFP-Nl上，构建重组质粒PEGFP-NI-AQp9。将其转染L-02细胞，通过荧光显微镜观察其转染情况，RT-PCR 和WeStembIot检测

2、AQP9基因在细胞中的表达。通过油红O染色，测定甘油二酯、游离脂肪酸及甘油含量检测其对L-02细胞脂肪变 性模型的作用C结果成功构建PEGFP-Nl-AQP9重组质粒，并能在L-02细胞中表达，将其转染L-02细胞脂肪变性模型后，油红O 染色可见油酸pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高，油酸pEGFP-NI-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂 肪酸及甘油含量分别为5.4350.337 mmol/L、2.0160.144 mmol/L&l.4850.113 nmolL,而油酸组分别为3.2180.220 mmol/L、 L5380.193mmolL及1.024 0.1

3、48mmolL,两者之间有显著的差异(PVo.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加 重结论AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病。I关键词水通道蛋白9；非酒精性脂肪肝病；重组质粒：基因治疗中图法分类号R575.HR589.2文献标志码I AThe study of recombinant AQP9 in nonalcoholic fatty liver disease cellular modelsWang Chuan, Yuan Yuan. Jiang Zheng, Wang Pilong (Department of Gastroenterology, the Fir

4、st Affiliated Hospital, Chongqing Medical University 400016)Abstract Objective Tb construct the recombinant eukaryotic expression plasmid of human aquaglyceroporin9 (AQP9), to examine its expression in eukaryotic expression liver cell L-02 and to detect its effect in nonalcoholic fatty liver disease

5、 (NAFLD) cellular models, in order to lay the foundation for elucidating the human AQP9 in pathogenesis of NAFLD. Methods Total mRNA was extracted from human hepatic tissue, the human AQP9 gene was obtained by RT-PCR and cloned into pEGFP-N 1 vector, and then the recombinant plasmid pEGFP-N 1 -AQP9

6、was transfected into L-02, the transfection was detected by fluorescent microscopy, the expression of AQP9 gene in cell was detected by RT-PCR and Western Blot, detected its effect in NAFLD cellular models by Oil Red O staining, determination of TG, FFA and glycerol content. Results The recombinant

7、plasmid pEGFP-N 1-AQP9 was constructed and it could express in L-02, it was transfected into the steatosis models of L-02 cell, Oil Red O staining showed oil red/transfected by pEGFP-N 1-AQP9 group intracellular lipid content was significantly increase than oil red group, oil red/transfected by pEGF

8、P-N 1 -AQP9 group intracellular triglycerides, free fatty acids and glycerol content were 5.435 0.337 mmolL, 2.016 0.144 mmol/L and 1.485 0.113 mmolL, while Oleic acid group were 3.218 0.220 mmol/L, 1.538 .193 mmol/L and 1.024 0.148 mmol/L, there was a significant difference (P0.01), it showed incre

9、ase the expression of AQP9 could aggravate the degree of steatosis. Conclusion AQP9 abnormal increase can cause or worsen NAFLD, lay the foundation for further study on the gene therapy of NAFLD with AQP9.Key words Aquaglyceroporin9; AQP9; Nonalcoholic fatty liver disease; Recombinant vector; Gene t

10、herapySupported by the General Program of National Natural Foundation of China (); the Medical Science and Technology Research Project of Chongqing Health Bureau (2010-2-100). Corresponding author: Jiang Zheng, Tel: (023), E-mail:基金项目国家自然科学基金面上项目0：重庆市卫生局医学科学技术研究项目(渝卫科教20102-100)通信作者姜政,电话：(023), E-ma

11、il:非酒精性脂肪肝病是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征。目 前针对非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic falty liver disease,NAFLD)还没有特效药物，随着西方化的饮食方式及 生活水平的提高，使其发病率迅速增加，已经成为危害人类健康的主要消化系疾病之一P,对其治疗和预防 的迫在眉睫。NAFLD与脂肪重新分布有关，而脂肪的动员运输和肝脏的摄取又与水通道蛋白(aquaglyceroporin9, AQP9)相关阳AQP9主要表达于肝细胞窦状隙膜上，能将血液中甘油转运进入肝细胞，大量甘油进入肝细 胞将引起脂肪合成及蓄积增加，从而导致脂

12、肪肝的形成。本研究通过RT-PCR从人肝脏组织中获得AQP9基因， 构建重组质粒PEGFP-NI-AQP9,并验证其在COS-7细胞及L-02细胞中的表达，通过油红O染色，测定细胞内脂 质含量检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用。为进一步研究AQP9在非酒精性脂肪肝病的发生、发展中的作 用奠定基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞人肝脏组织取自本院肝胆外科手术患者(经患者同意)；人正常肝细胞株L-02购自中科院上海细胞库。1.1.2 主要试剂及工具酶RNAiSoPhis、RT-PCR试剂盒，限制性内切酶购自大连TaKaRa公司；凝胶回收纯化试剂盒，质粒小量提取试剂盒，无内毒素质

13、粒小量提取试剂盒购自美国OMEGA公司；油酸购自美国Sigma 公司；LiPOfeCtamine 2000, Opti-MEM培养基购自美国InVitrOgen公司；兔抗人AQP9抗体购自美国Santa Cruz 公司；甘油三酯检测试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司：游离脂肪酸检测试剂盒购自南京建成生物_ 程研究所；甘油含量GPO-POD酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建根据NCBl中人AQP9的基因序列（ABOO8775）,设计AQP9巢式PCR外侧上游引物：5,-gAtttcgggttctaagtcgc-3,外侧下游弓I物：5二GAGA

14、ATCCCAAACTGACTGC-3,内侧上游引物： 5-GGAAGATCTGATGCAGCCTGAGGGAG-3 , 内 侧 下 游弓I物：5,GGGGTACCCTGAGTTCAATTCTCTGG-3,内侧上下游引物分别加入8g及&I酶切位点其保护碱 基，产物长度为888bp.同样方法设计AQP9短片段PCR引物，上游引物：5-CTTTGG ACGG ATG A A ATGGTT-3, 下游引物：5：GAGTCAGGCTCTGGArGGTG3,产物长度为546bp。提取人肝脏组织总RNA,反转录合成cDNA, 采用巢式PCR扩增AQP9基因，所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，并进

15、行凝胶向收纯化。分别将AQP9 基因和PEGFP-NI质粒进行四川 和他 I双酶切，而后凝胶回收纯化。将AQP9和PEGFP-NI用T4 DNA Ligase连 接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5,同时以空质粒及ddH2O为对照，挑取经卡那霉素筛选的阳性克隆 摇菌扩增并提取重组质粒，命名为PEGFP-Nl-AQP9。1.2.2 重组质粒的鉴定1.2.2.1 PCR鉴定取重组质粒菌液1 l煮沸，同时以空质粒菌液、DH5菌液及ddltO为对照，分别加入AQP9内侧引物进行PCR反应，所获产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。1.2.2.2 酶切鉴定将PEGFP-NI-AQp9与PEGFP-Nl

16、分别进行单酶切（BgIll）及双酶切（Bg八1和KM I ）,酶切产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。1.2.2.3 测序鉴定将PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送至上海生工测序，使用T7通用引物，将测序结果与GenBankAQP9 mRNA序列进行比对。1.2.3 重组质粒在L-02细胞中的表达1.2.3.1 重组质粒转染LQ2细胞 用含有10%胎牛血清的1640培养L-02细胞，置于37C、5% CO2孵箱中培养， 传至第3代用于转染。转染前1天，将L-02细胞接种6孔板上，每孔接种约7xl05个，待细胞达80%90%融合度时， 将无内毒素的PEGFP-NI-AQP9以脂质体LiPOfeCtamine 2000介导的方法转染L-O2细胞，并以PEGFP-N1、ddH2O 未处理L-02细胞为对照，每组转染2孔，48 h后