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1、高铁还原酶(ferricchelatereductase,FCR)试剂盒说明书微法IoOlf/96样注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义:高铁还原酶(ferric-chelatereductase,FCR)催化高价铁螯合物中的Fe3+还原为Fe2+,在部分物种铁元素的吸收中有重要作用。渊定原理:FCR催化Fe3+还原为Fe入,Fe”和ferrozine反应显色,在562nm下有特征吸光值。自备用品:可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂组成和配制:试剂一:液体6mLxl瓶,4匕避光保存;试剂二:液体6mLx
2、l瓶,4七避光保存;试剂三:液体6mLxl瓶,4七保存。粗液提取:按照组织质量(g):水(mL)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL蒸储水),进行冰浴匀浆。IoOoog4C离心Iomin,取上清,置冰上待测。渊定步骤:1、分光光度计或函标仪预热30min以上,调节波长至562nm,蒸储水调零。2、工作液配制:将试剂一、二、三以1:1:1的比例混合。临用前配制,用多少配多少。3、在微量石英比色皿/96孔板中,加入50L样本上清和150L工作液,混匀,记录初始吸光值Al和30min后的吸光值A2。A=A2-A1FCR活性计算:派用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线:y=8.
3、0014x+0.0011,R2=0.9997;(1)按样本质量计算单位定义:每g样本每分钟产生InmolFe2+-ferrozine定义为一个醉活力单位。FCR(nmol/min/g鲜重)=(A-0.0011)8.0014xl(XX)xV标(V样V样总XW)T=4.166(A-0.0011)W(2)按样本蛋白浓度计算单位定义:每mg蛋白每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。FCR(nmol/min/mgprol)=(A-0.0011)8.0014xl000xV标(V样V样总XCPr)T=4.166(A-0.0011)CprV样总:加入提取液体积,1mL;V样:反
4、应中样品体枳,50L;V标:加入标准品体积,5OL;T:反应时间,30min:W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;1000,mol到nmol的转换系数。b.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线:y=4.0007x+0.0011,R2=0.9997;y,吸光度(1)按样本质量计算单位定义:每g样本每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个所活力单位。FCR(nmol/min/g鲜重)=(A-0.0011)4.0007x1000xV标(V样V样总xW)T=8.331(A-0.0011)W(2)按样本蛋白浓度计算单位定义:每mg蛋白每分钟产生InmOlFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位。FCR(nmol/min/mgprol)=(A-0.0011)4.0007xl000xV标(V样V样总xW)T=8.331(A-0.0011)CprV样总:加入提取液体积,1mL;V样:反应中样品体积,50L;V标:加入标准品体积,50L;T:反应时间,30min:W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;1000,mol到nmol的转换系数。