过氧化氢酶的活力和动力学常数测定生化实验技术.ppt

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1、 实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定高锰酸钾滴定法高锰酸钾滴定法一、实验目的一、实验目的l1.掌握酶活力测定的方法掌握酶活力测定的方法l2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理l3.掌握测定过氧化氢酶米氏常数的基本原理和掌握测定过氧化氢酶米氏常数的基本原理和方法方法二、实验原理二、实验原理l过氧化氢酶（过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。是还原剂。

2、lR(Fe2+)+H2O2=R(Fe3+OH)lR(Fe3+OH)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2l总反应式总反应式：2 H2O2 2H2O+O2过氧化氢酶过氧化氢酶l据此，可根据据此，可根据H2O2的消耗量或的消耗量或O2的生成量测定的生成量测定该酶活力大小。该酶活力大小。l在反应系统中加入过量的在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的定多余的H2O2，即可求出消耗的，即可求出消耗的H2O2的量。的量。l5 H2O2+2KMnO4+4H2SO4=5O2+2KHSO4+8

3、H2O+2MnSO4l酶促反应速度可用单位时间底物的减少量表示，即求酶促反应速度可用单位时间底物的减少量表示，即求出单位时间内反应前后出单位时间内反应前后H2O2浓度差，即可计算出酶促浓度差，即可计算出酶促反应速度。反应速度。l米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法（LineweaveR-Burk法）如下：法）如下：S为底物浓度（为底物浓度（mol/L）v0为初速度（为初速度（mol/L*min）vmax为最大反应速度（为最大反应速度（mol/L*min）Km为米氏常数（为米氏常数（mol/L）l用双倒数法（以用双倒数法（以1/v0对对1/S作图）作图）计算米氏常

4、数计算米氏常数Km和最大反应速度和最大反应速度vmaxmaxmax011vSvKvm三、材料、试剂与器具三、材料、试剂与器具 1.1.材料：材料：新鲜马铃薯2.2.试剂：试剂：（1）10%H2SO4；（2）0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；（3）0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。高锰酸钾溶液标定：高锰酸钾溶液标定：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10%H2SO4H2SO4溶液于锥形瓶中，溶液于锥形瓶中，加热至（加热至（75758585）（见冒热气），趁热用（见冒热气），趁热用KMnO

5、KMnO4 4标准溶标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnOKMnO4 4标准溶液摇动，标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴待溶液褪色，再加第二滴KMnOKMnO4 4（此时生成的（此时生成的MnMn2+2+起催化作起催化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈滴定中始终不能过快，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。l离子反应方程式：离子反应方程式：2MnO2MnO4 4-+5C+5C

6、2 2O O4 42-2-+16H+16H+2 Mn 2 Mn 2+2+10CO+10CO2 2+8 H+8 H2 20 0l计算公式：标定的计算公式：标定的 KMnO4KMnO4 C=0.2/V mol/L C=0.2/V mol/L（4）0.1mol/L H2O2：市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；（5）0.1mol/L草酸钠：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。3.器具器具（1）恒温水浴；（2）研钵；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10

7、ml）；容量瓶25ml1等四、实验步骤四、实验步骤（一）酶液提取（一）酶液提取l取新鲜马铃薯取新鲜马铃薯5g加入加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至研磨成匀浆，转移至50ml容量瓶中，用该缓冲液容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，缓冲液定容，4000rpm离心离心15min，上清液即为，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。过氧化氢酶的粗提液。（二）酶活力的测定（二）酶活力的测定1.反应反应l取取50ml三角瓶三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入个（两个测定两个对照），测定瓶中加

8、入酶液酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于，同时计时，于30恒温水浴中保温恒温水浴中保温10min，立即加入，立即加入10%H2SO4 2.5ml。2.滴定滴定l用用0.02mol/L KMn4标准溶液滴定标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色，至出现粉红色（在（在30s内不消失）为终点。内不消失）为终点。3.计算计算l酶活力用每克鲜重样品酶活力用每克鲜重样品1min内分解内分解H2O2的毫克数表示的毫克数表示l酶活酶活(mgH2O2/gmin)=l式中：式中：A对照对照KMnO4滴定毫升数；滴定毫

9、升数；B酶反应后酶反应后KMnO4滴定毫升数；滴定毫升数；VT酶液总量（酶液总量（ml）；）；V1反应所用酶液量（反应所用酶液量（ml）；）；F W样品鲜重（样品鲜重（g）；）；1.71ml 0.02mol/L的的KMnO4相当于相当于1.7mg H2O2().ABVFWVtT171（三）动力学常数的测定（三）动力学常数的测定（vmax和和Km）l取取100mL锥形瓶锥形瓶5个，编号后按下表加入试剂个，编号后按下表加入试剂l各瓶分别加好各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液和蒸馏水后，再依次加入酶液0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。反应，混匀，记录各瓶起始反应的时间。反应5mi

10、n后立即加入后立即加入25%H2SO4 2.0mL终止反应，终止反应，试剂编号123450.05mol/L H2O2(mL)1.001.251.672.505.00蒸馏水(mL)8.508.257.837.04.51.反应反应l用用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，至微红色，记录消耗的记录消耗的KMnO4溶液毫升数。溶液毫升数。l分别求出各瓶反应前后的底物浓度分别求出各瓶反应前后的底物浓度S0、S1，并计算反，并计算反应速度应速度v0：S0=C1V1/10 S1=2.5C2V2/10 v0=(C1V1-2.5C2V2)/5l以以1/v0对对1/S

11、作图作图 求出求出Km和和Vmax （用（用excel作图）作图）2.滴定滴定3.计算计算S0为反应前的底物浓度（为反应前的底物浓度（mol/L）S1为反应后的底物浓度（为反应后的底物浓度（mol/L）C1为为H2O2的浓度（的浓度（mol/L）C2为为KMnO4用液的浓度（用液的浓度（mol/L）V1为为H2O2的体积（的体积（mL）V2为滴定消耗的为滴定消耗的KMnO4用液的体积（用液的体积（mL）v0为反应速度（为反应速度（mmol/min）5为反应时间（为反应时间（min）10为反应液体积（为反应液体积（mL）注意事项注意事项l每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在每个三角瓶内的酶促反

12、应时间要精确控制在5min。l各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。l使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。该保证逐滴加入。六、研讨题六、研讨题l1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?l2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关过氧化氢酶与哪些生化过程有关?l3.什么是酶的什么是酶的Km和和Vmax？如何测定？如何测定？l4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？l5.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是法，原理是H2O2在在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。酶活力的实验。