第6节载体系统.ppt

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1、1 1 质粒载体质粒载体2 2 噬菌体载体噬菌体载体3 3 cosmid克隆载体克隆载体4 4 噬菌粒载体噬菌粒载体5 5 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体6 6 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体1.1 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1.2 基因工程中的质粒载体基因工程中的质粒载体1.3 pBR322质粒载体质粒载体1.4 pUC质粒载体质粒载体1.5 穿梭质粒载体穿梭质粒载体1.6 质粒载体的稳定性问题质粒载体的稳定性问题1.1.1 1.1.1 质粒的概念质粒的概念 质粒（质粒（plasmidplasmid）是独立于染色体外、具）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位

2、，其本质是较有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb1kb-200kb以上以上不等。不等。1.1.2 1.1.2 细菌质粒的一般生物学特性细菌质粒的一般生物学特性(1)(1)很多细菌中已发现；很多细菌中已发现；(2)(2)是独立于细菌染色体之外的辅助性遗是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状传单位，基因组绝大部分为双链环状DNADNA，不同质粒大小各异；，不同质粒大小各异；(3)(3)大多数质粒的宿主范围较窄；大多数质粒的宿主范围较窄；(4)(4)已发展进化出多种机制以维持其在已发展进化出多种机制以维持其在

3、细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。同的宿主细胞中拷贝数可能不同。(5)(5)复制转录的进行依赖于宿主编码的复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；酶和蛋白质；(6)(6)常含有一些编码对细菌宿主有利的常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。酶的基因。单链切割单链切割连接连接单链切割单链切割连接连接共价闭合环形共价闭合环形DNA（scDNA型）型）开环开环DNA（ocDNA）线性线性DNA（cccDNA）环形双链的质粒环形双链的质粒DNADNA分子具有三种不同构型分子具有三种不同构型 用小写字母用小写字母p代表质粒代表质粒（plasmid

4、），在），在p字字母后用母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称者或实验室名称，再加上，再加上质粒编号质粒编号。如：如：pBR322：p表示一种质粒，而表示一种质粒，而“BR”则则是分别取自该质粒的两位主要构建者是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和和R.L.Rodriguez，322为编号。为编号。(1)(1)氨苄青霉素氨苄青霉素 (Ampicillin(Ampicillin)(2)(2)卡那霉素卡那霉素 (Kanamycin(Kanamycin)(3)(3)四环素（四环素（TetracyclineTetracycline）(4)(4

5、)氯霉素氯霉素(C(Chloramphenicolhloramphenicol)(5)(5)链霉素（链霉素（StreptomycinStreptomycin）(6(6）潮霉素（）潮霉素（HygromycinHygromycin ）据质粒据质粒DNADNA复制与宿主之间的关系分为：复制与宿主之间的关系分为：（1 1）“严紧型严紧型”复制控制的质粒复制控制的质粒(stringent plamid(stringent plamid)：拷贝数少：拷贝数少 ；（2 2）“松弛型松弛型”复制控制的质粒复制控制的质粒(relaxed(relaxed plasmid)plasmid)：拷贝数多。：拷贝数多。(

6、1)质粒的类型质粒的类型 据能否自我转移可分为据能否自我转移可分为:接合型接合型（conjugative plasmid)非接合型非接合型（non-conjugative plasmid)(2)F质粒质粒(fertility factor)F+又叫雄性决定因子，所以又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相细胞又叫雄性细胞，相应的应的 F 又叫雌性细胞。又叫雌性细胞。F质粒质粒(约约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：在寄主细胞中有三种不同存在方式：F+F Hfr。转化（转化（transformation）：是将异源是将异源DNADNA分子引入另一细胞品系，分子引入另一细胞品系，使受

7、体细胞获得新遗传性状的一种手段。使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。质粒转化质粒转化细菌细菌常用常用方法：方法：热激法、电击法热激法、电击法 1.2.1 两个概念两个概念克隆载体克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（表达载体（Expression Vector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白或蛋白质的载体。质的载体。（1 1）具有复制起点）具有复制起点（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）具有若干限制酶单一识别位点）具有若干限制酶单一识别位点（4

8、4）具有较小的相对分子质量和较高的）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。拷贝数。(1)(1)能自主复制能自主复制(2)(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记(3)(3)具有能为具有能为 RNARNA聚合酶识别的强大启动子聚合酶识别的强大启动子(4)(4)启动子应可受诱导调控启动子应可受诱导调控(5)(5)具有强终止子具有强终止子(6)(6)具有翻译起始信号具有翻译起始信号 1.2.4 天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性天然质天然质 粒粒 相对分子质量相对分子质量拷贝数拷贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记复制类型复制类型pSC10

9、15.81069.09 kb13EcoR Itetr严紧严紧ColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I(BamH I)ampr松弛松弛局限性：局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、位点少、选择标记不合适选择标记不合适常用的选择标记：常用的选择标记：抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。霉素等基因。选择标记的应用：选择标记的应用：利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。pBR322质粒载体

10、的形体图质粒载体的形体图pBR322质粒载体的结构来源质粒载体的结构来源TetrAmprOripBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点：具有较小的相对分子质量具有较小的相对分子质量(4363bp)具有两种抗菌素抗性基因可供作具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号转化子的选择记号(Ampr和和Tetr)具有较高的拷贝数（具有较高的拷贝数（15个个,松弛型）松弛型）DNA连接酶连接酶pBR322质粒载体质粒载体tetr基因插入失活效应基因插入失活效应pUC18pUC19含四个部分：含四个部分：（1）来自）来自pBR322的质粒的质粒复制起点（复制起点（ori）；）；（2）ampr;（3）大

11、肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ）的启动子及其）的启动子及其编码编码-肽链的肽链的DNA序列；序列；（4）多克隆位点）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS Blue WhiteampramprInsertInsertNo insertLac ZLac Z 具更小的分子质量具更小的分子质量(2.69kb)(2.69kb)和更和更 高的拷贝数高的拷贝数(500-700(500-700个个)适于组织化学方法检测重组体适于组织化学方法检测重组体 具多克隆位点具多克隆位点MCSMCS区段区段1.5 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）

12、是一类由人工构建的具有两种不同复制是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母酿酒酵母穿梭质粒载体穿梭质粒载体能能在在体体外外转转录录克克隆隆基基因因的的质质粒粒载载体体（1 1）不稳定性类型）不稳定性类型 分离不稳定性分离不稳定性 结构不稳定性结构不稳定性（2 2）影响稳定性主要因素）影响稳定性主要因素 新陈代谢负荷新陈代谢负荷 拷贝数差度拷贝数差度2.1 2.1 噬菌体的结构及其核酸类型噬菌体的结构及其核酸类型2.2 2.2 噬菌体的生命周期噬

13、菌体的生命周期2.3 2.3 噬菌体载体噬菌体载体2.4 M132.4 M13噬菌体载体噬菌体载体2.1 2.1 噬菌体的结构及其核酸类型噬菌体的结构及其核酸类型 不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。三种不同基本类型：三种不同基本类型：无尾部的二十面体型无尾部的二十面体型 具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）线状体型线状体型T2噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图 2.2 2.2 噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期（1 1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2 2）溶源生长周期噬菌

14、体（温和噬菌体）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期）烈性噬菌体的生活周期t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内秒钟内就会发生噬菌体就会发生噬菌体DNA的注入；的注入；t=1 寄主寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2 第一个噬菌体第一个噬菌体mRNA开始合成；开始合成；t=3 细菌细菌DNA开始降解；开始降解；t=5 噬菌体噬菌体DNA合成开始启动；合成开始启动；t=9 “晚期晚期”噬菌体噬菌体mRNA开始合成；开始合成；t=12 出现完整的头部和尾部结构；出现完整的

15、头部和尾部结构；t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒；出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒个左右的噬菌体时粒E.coliE.coli T4 T4噬菌体的生命周期（以分钟记）噬菌体的生命周期（以分钟记）裂解循环裂解循环溶源态溶源态（2）温和噬菌体的生活周期）温和噬菌体的生活周期cI OR PR PL OL基因基因早期左向转录早期左向转录早期右向转录早期右向转录基因基因噬菌体的阻遏噬菌体的阻遏-操纵基因系统操纵基因系统CI=阻遏基因；阻遏基因；P=启动子；启动子；O=操纵基因；操纵基因；L=左向；左向；R=右向右向注：注

16、：cI基因和基因和cro基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（OL，OR）之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。2.3 2.3 噬菌体载体噬菌体载体2.3.1 2.3.1 噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述2.3.2 2.3.2 噬菌体载体噬菌体载体2.3.1 2.3.1 噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述 噬菌体颗粒中的噬菌体颗粒中的DNADNA是一线性双链是一线性双链DNADNA分分子，长子，长48 502bp48 502bp，两端各有，两端各有1212个碱基的个碱基的55凸出黏性末端是互补的。进入细胞的凸出黏性末端是互补的。进入细胞的DNADNA通过两端的黏性末端环化。通过两端的黏性末端环化。噬菌体上有些基因可被取代而不影响其噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。生活周期。噬菌体噬菌体DNADNA的核酸内切限制酶的限制图（的核酸内切限制酶的限制图（KbKb）噬菌体载体可