第6章转录后加工.ppt

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1、第第6章章 Pre-RNA processing 6.1 原核生物rRNA和tRNA转录后加工6.1.1 rRNA转录后加工6.1.1 tRNA转录后加工原核细胞原核细胞rRNA前体的加工前体的加工 6.1.1 rRNA转录后加工转录后加工 tRNAIle tRNAAla tRNAAsp tRNATrp 16S 23S 5S RNaseIII RNaseIII RNaseIII RNaseIII RNaseR RNaseR RNaseR RNaseR RNaseR 图 13-rRNA的加工rRNA的加工的加工tRNA的加工分成的加工分成3个阶段个阶段“斩头斩头”：形成形成5末端末端RNase

2、P具有内切酶的活性，可具有内切酶的活性，可切除前体切除前体tRNA 5端的前导序列（端的前导序列（41nt）去尾：去尾：切除多余的核苷酸形成切除多余的核苷酸形成3-OH末端。缺末端。缺-CCA的的 tRNA要用要用tRNA核酸转移酶核酸转移酶加加-CCA修饰修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（硫尿苷（4tu），），D臂的臂的2甲基鸟甲基鸟苷（苷（2mG），），TC臂的假尿苷（臂的假尿苷（）和反密码子环上的）和反密码子环上的2异戊腺苷（异戊腺苷（2ipA)6.1.2.tRNA的加工的加工6

3、.2 Pre-RNA processing in Euk.6.2.1 概念概念pre-RNAcapping tailingsplicing methylationediting 生物学意义生物学意义;mature RNA prevent pre-RNA from digested by RNase as template (protein translation)l interrupted gene(interrupted RNA)move introns(stop codon)6.2.2 pre-RNA capping Cap-0 m7GpppXpYp-(共有共有)Cap-1 m7GpppX

4、mpYp-Cap-2 m7GpppXmpYmp-1、帽子的种类帽子的种类HNCH3m7G帽子帽子0其中其中:单细胞真核生物只有单细胞真核生物只有 Cap0 Cap1 是其余真核生物的主要帽子形式是其余真核生物的主要帽子形式 Cap2 存在于某些真核生物中存在于某些真核生物中2、帽子结构的生成帽子结构的生成 甲基供体都为甲基供体都为S腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM）RNA鸟苷酸转移酶鸟苷酸转移酶-戴帽酶（戴帽酶（capping enzyme）3、帽子结构的功能帽子结构的功能 （1）对翻译起识别作用对翻译起识别作用-为核糖体识别为核糖体识别RNA提供信号提供信号 Cap0 的全部都是识别的重要

5、信号的全部都是识别的重要信号 Cap1,2 的甲基化能增进识别的甲基化能增进识别 （2）增加增加mRNA 的稳定性，使的稳定性，使5端免遭外切核酸酶的攻击端免遭外切核酸酶的攻击 （3）与某些与某些RNA病毒的正链合成有关病毒的正链合成有关 （Cap1、Cap2）除帽子结构外的除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化内部甲基化m6A形式形式6.2.3 pre-RNA tailing 1、3端端-约长约长200bp (大多数大多数Euk.的的mRNA)（poly(A)+poly(A)-）最近研究发现，原核生物的最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有转录后也有3添加添加 poly(A)的现象的现象

6、 E.coli 的的poly(A)+聚合酶早在聚合酶早在1962年就已发现年就已发现 2、poly(A)的生成的生成 a、RNA末端腺苷酸转移酶（末端腺苷酸转移酶（poly(A)聚合酶）催化聚合酶）催化 前体前体ATP反应如下：反应如下：多聚核糖核酸多聚核糖核酸 +nATP Mg+或或 Mn+多聚核糖核酸多聚核糖核酸(A)n +nPPi b、添加位点、添加位点 内切酶内切酶(360KDa)切除一段序列切除一段序列 由由poly(A)聚合酶聚合酶 催化添加催化添加poly(A)内切酶的识别位点（有其它因子参与）内切酶的识别位点（有其它因子参与）切点上游切点上游 1320bp处的处的 AAUAAA

7、 切点下游的切点下游的 GUGUGUG（单细胞（单细胞Euk.除外）除外）Proceeding of pre-RNA tailing Proceeding of pre-RNA tailing Recognizing siteRecognizing siteCapCap 特异特异 内切酶识别内切酶识别AAUAAA及随后的及随后的GUGUGUG并在其间并在其间酶切，在酶切，在3端聚合端聚合50-200poly(A)GUGUGUG 3、poly(A)的功能的功能 c、对含、对含 poly(A)的的mRNA 失去失去 poly(A)可减弱其翻译可减弱其翻译 （1）可能与核质转运有关可能与核质转运有关

8、 （2）与与mRNA的寿命有关的寿命有关 （3）与翻译有关与翻译有关 a、缺失可抑制体外翻译的起始缺失可抑制体外翻译的起始 b、胚胎发育中，胚胎发育中，poly(A)对其对其mRNA的翻译有影的翻译有影 响（非响（非poly(A)化的为储藏形式）化的为储藏形式）（4）poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值在分子生物学实验中有很大应用价值 a、也可将也可将 oligo(dT)与载体相连，从总体与载体相连，从总体RNA中分离中分离 纯化纯化mRNAb、用寡聚用寡聚dT（oligo(dT)）为引物，反转录合成）为引物，反转录合成 cDNA 6.2.4.Primary transcriptTh

9、e consensus sequences for humann5splice site(5剪接位点剪接位点):the exon-intron boundary at the 5 end of the intronn3 splice site(3剪接位点剪接位点):the exon-intron boundary at the 3 end of the intronnBranch point site(分枝位点分枝位点):an A close to the 3 end of the intron,which is followed by a polypyrimidine tract(Py tr

10、act).RNA splicing models a)group I of intron (chloroplast&mitochondrial)真核真核 生物细胞器基因，低等真核生物核生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因基因 Group II of intron :只见于某些真菌线粒体和植物叶只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因绿体基因 hnRNA 的拼接的拼接：需要剪接体需要剪接体,由核糖核蛋白介导由核糖核蛋白介导 tRNA基因的内含子基因的内含子均位于均位于 tRNA 的反密码环上的反密码环上四种内含子的边界序列各有一定共同的特征四种内含子的边界序列各有一定共同的特征拼接方式拼接方式

11、 方式一：由拼接装置完成（核方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）内含子）可供识别的特异序列可供识别的特异序列 拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成 方式二：自我拼接（两类内含子方式二：自我拼接（两类内含子、）形成特定的二级结构形成特定的二级结构 RNA具有催化拼接的能力具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应前两种拼接都属于转酯反应b)I类内含子拼接特点类内含子拼接特点 (四膜虫四膜虫 35s rRNA model)5-exon-UpA-intron-GpU-exon-3 高

12、度保守，转酯反应的攻击位点高度保守，转酯反应的攻击位点 2、拼接机制（以四膜虫的大拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）前体的拼接为例）P295 （1）两种两种rRNA转录在一条转录在一条35S的产物中，的产物中，26SrRNA 有内元有内元 5 U G 3 小小rRNA 大大rRNA（26S 有内含子）有内含子）（2）35SRNA体外有自我拼接的能力体外有自我拼接的能力 反应需要：一价和二价离子反应需要：一价和二价离子 鸟苷酸辅助因子（鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和和 鸟嘌呤核苷）鸟嘌呤核苷）不需能量的供给不需能量的供给 （3）拼接反应后，拼接反应后，G与内与内含子含子（4

13、14base）5端以磷酸二端以磷酸二酯键相连酯键相连（4）具体的拼接过程具体的拼接过程 第一步：第一步：游离游离G发动的转酯反应发动的转酯反应 G 的的 3-OH 攻击内元的攻击内元的 5拼接点拼接点 第二步：第二步：游离外显子（左）发动的转酯反应游离外显子（左）发动的转酯反应 左外左外显子显子的的3-OH 攻击攻击3拼接点，同时释放拼接点，同时释放 线状的内线状的内含子含子,形成形成成熟成熟RNA分子分子 两次转酯反应是紧密偶联的两次转酯反应是紧密偶联的 释放出的内含子可继续进行转酯反应释放出的内含子可继续进行转酯反应 而形成环状而形成环状 型内含子的自我剪接四膜虫35S rRNA前体的剪接

14、反应是型的典型代表。特点是需要鸟苷参与。自由鸟苷酸的自由鸟苷酸的3-OH作为亲核基团攻击内含子的作为亲核基团攻击内含子的5端的端的磷酸二酯键，从上游切开磷酸二酯键，从上游切开RNA链链 整个过程不需能量整个过程不需能量，由，由RNA自身催化，酶和底物均为自身催化，酶和底物均为RNA，其中的内含子为，其中的内含子为RNA重排酶，反应本质为二次转酯重排酶，反应本质为二次转酯反应反应 上游外显子的自由上游外显子的自由3-OH作为亲核基团攻击内含子作为亲核基团攻击内含子3位位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。科罗拉多大学科罗拉多大学Cech等人完成（美

15、）等人完成（美）活性位点活性位点（4）总结：总结：四膜虫的四膜虫的 35SRNA 的内含子有自身催化的性质的内含子有自身催化的性质 即即-将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷 酸二酯键，不需要额外的能量酸二酯键，不需要额外的能量 因此因此：内内含子含子可以看作是可以看作是 RNA重排酶（重排酶（RNA rearrangease）或或 RNA异构酶（异构酶（RNA isomerase）其中：其中：拼接反应中，拼接反应中，“酶酶”和底物是同一个分子，且反应后和底物是同一个分子，且反应后 变成了不同的分子变成了不同的分子主要特征：主要特征：专一性强专一性强

16、 加快反应速度加快反应速度 反应前后酶分子保持不变反应前后酶分子保持不变 人们称这种由人们称这种由RNA构成的酶为构成的酶为-核糖核酸酯酶（核糖核酸酯酶（ribozyme）可简称可简称 R酶酶c)II 类内含子拼接特点类内含子拼接特点(Michel 1982)拼接点序列拼接点序列 7核苷酸的保守序列核苷酸的保守序列（Branch Site ）3 拼接点上游拼接点上游 6bp 12bp 处处 5-exon-GUGCG-B.S-Py AU-exon-3 供点供点受点受点-Py Pu Py Py U A Py-100%型内含子的自我剪接不需要鸟苷参与，而由其自身结构决定。特点是形成套索内含子。E complexA complexB complexC complex（d）splicesome介导的拼接反应介导的拼接反应 1、相关概念、相关概念 Euk.的细胞中，有许多碱基数在的细胞中，有许多碱基数在100 300之间之间 的小分子的小分子RNA,每个细胞有每个细胞有 105106个个 lariaf structure（套索结构）拼接点序列拼接点序列 Breathnach-Chambon rul