眼科真菌性角膜炎诊疗技术.docx

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1、眼科真菌性角膜炎诊疗技术真菌性角膜炎(fungalkeratitis)是严重的致盲性眼病，由于发病与植物外伤有关，中国是农业大国，目前真菌性角膜炎已成为我国部分地区首位的感染致病菌。一、真菌的一般特性真菌是一种真核细胞微生物，细胞结构比较完整，有细胞壁和完整的核，少数为单细胞，大多为多细胞，由丝状体和抱子组成。真菌种类繁多，有10余万种，引起人类疾病约200余种，有报道70余种可引起角膜的感染。二、真菌的生物学特性真菌与细菌在结构、形态及组成上有很大的差别。真菌比细菌大几倍至几十倍，体外有一层坚硬的细胞壁，一般由四层不同结构组成，最外层是糖菌类；第二层是糖蛋白；第三层是蛋白质；第四层是几丁质的

2、微原纤维。各种真菌细胞壁的结构不完全相同，菌丝与抱子外的细胞壁结构也不相同。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，称酵母菌。多细胞真菌大多长出菌丝与电子，交织成团，称丝状菌或霉菌。有些真菌可因环境条件的改变，两种形态可以互变。酵母菌的形态与结构，外形与细胞很相似，以出芽方式繁殖，芽生抱子成熟后脱落成独立体。角膜很少有酵母菌感染。丝状菌能长出菌丝，菌丝延伸分枝，长出抱子，各种丝状菌长出的菌丝与泡子形态不同，是鉴别的重要标志。(一)菌丝真菌的泡子以出芽方式繁殖，逐渐延长至丝状，按菌丝的功能可分为营养菌丝，为部分向下生长深入被寄生的组织或培养基中，吸取和合成养料的菌丝。按菌丝的结构分为有隔和无隔菌丝两类。(二)

3、抱子是真菌的繁殖器官，一条菌丝上可长出多个泡子。在环境适宜的条件下，泡子又可发芽伸出芽管，发育成菌丝体。电子又分；分生抱子：由生殖菌丝末漏细胞分裂或收缩形成，也可在菌丝侧面出芽形成；叶状抱子：由菌丝内细胞直接形成；抱子囊泡子：为菌丝末漏膨大成抱子囊，内含许多抱子。三、致病性(1)致病性感染：主要是一些外源性真菌感染，角膜感染以外源性为多见，通过机械刺激和代谢产物作用，引起局部的炎症和病变。(2)条件致病性真菌感染：常见于眼科长期应用广谱抗生素和糖皮质激素后继发感染。四、发病机理各种致病性真菌确切的致病因子还不完全清楚。致病性真菌中，只有极少数在一定条件下可使正常人致病，多数发病则与全身或局部的

4、防御功能障碍有关。机体对真菌的防御功能包括非特异性和特异性两方面。（一）对真菌的非特异性防御功能人类对真菌的非特异性防御功能包括屏障因素、体液因素和细胞因素。1.屏障因素屏障因素指角膜上皮防御功能。完整的正常角膜上皮能防止真菌侵入。有报道正常人结膜囊内培养真菌的阳性率为10%60%不等。但这些人并没有发生真菌性角膜炎，只有角膜上皮损伤后才容易招致真菌感染。真菌一旦突破屏障因素，其他非特异的和特异的防御功能即被启动。如果真菌未能被机体排出或消灭，下述各种非特异的和特异的防御功能就可能形成病理反应，即真菌性角膜炎。2 .体液因素具有非特异防御功能的体液因素指血液、淋巴液、细胞间液、泪液中所含的各种

5、抗微生物的分子，包括体液中的补体系统、溶菌酶、干扰素、各种细胞因子等。补体激活的旁路途径可能被真菌多糖所激活而产生C3b、C3a、C5a等。C3a、C5a对中性粒细胞有趋化作用，且能使肥大细胞释放各种炎症介质。补体经典途径的激活，主要由抗原、抗体复合物启动。3 .细胞因素人体非特异性免疫细胞包括粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞等。中性粒细胞常见于真菌侵入处，可能因真菌本身能释放趋化因子；或因真菌激活补体旁路途径，产生C3a和C5a（C3a和C5a不但本身有趋化作用，并能使肥大细胞释放各种炎症介质）。中性粒细胞能吞噬真菌，并通过髓过氧化酶依赖性氧化系统而杀死真菌；中性粒细胞还能通过髓过氧

6、化酶非依赖活性而杀死真菌。当真菌或其产物中的抗原初次进入机体时，抗原呈递细胞摄取、加工抗原后，在淋巴系统内增殖。已致敏的特异性T细胞再循环到真菌侵入部位时，再次受到抗原呈递细胞表面的特异性真菌抗原的刺激，进行克隆增殖，释放各种淋巴因子。并招致各种淋巴因子聚集于局部，造成病理改变。这种病理改变可能消灭真菌而自愈；也可能因未能消灭真菌而长期存在，甚至波及全身其他部位。（二）真菌与角膜的黏附在真菌感染中的作用对许多真菌来说，黏附于宿主上皮的能力是其在宿主中集落形成及侵入体内的前提，也是感染发生的首要步骤，进一步黏附于细胞外基质（ECM）是感染扩散的必要条件。研究表明白念菌可与多种ECM成分如纤维连接

7、蛋白（fibronectin,FN）基膜连接蛋白（laminin,LN）、I型、IV型胶原、纤维蛋白原、明胶和补体结合，白念菌与ECM结合能力的强弱与其致病性成正比，说明与ECM的黏附能力为白念菌重要毒力因子。烟曲霉在体内体外可与多种ECM成分结合，LN和IV型胶原是构成肺泡上皮和毛细血管内皮下基底膜的主要成分，当上皮受损时，基底膜成分暴露，同时损伤后炎症反应导致纤维蛋白原合成增加并沉积于上皮表面,烟曲霉与这些成分接触并结合从而引起烟曲霉肺病的发生。真菌与宿主组织的黏附机制包括特异性配-受体反应和广泛的非特异性理化反应。研究证实白念菌、烟曲霉通过表面的多肽分子(受体)识别结合宿主细胞上的底物(

8、配体)，这种结合具有特异性和可饱和性。刀豆素A(Con-A)结合实验显示白念菌上与纤维蛋白原和LN结合的受体蛋白为甘露聚糖蛋白(mannoprotein,MP)oMP存在于大多数真菌细胞壁外层，可占细胞壁干重50%,扫描电镜发现烟曲霉菌与Iaminin结合受体分布于静息电子外层，SDS-PAGE分析显示此受体为胞壁上一种分子量为72kD的糖蛋白。研究还显示烟曲霉菌与纤维蛋白原和Iaminin以及C3结合的受体有同一性，受体结合于纤维蛋白原的D区和Iaminin的Pl区。烟曲霉泡子除与纤维蛋白原和Iaminin有高亲和力外，还可结合纤维连接素及胶原成分，与纤维连接素结合受体分子量为23kD和30

9、kD的多肽，且识别依赖于RGD序列。细胞壁外层结构对袍子黏附性能起重要作用。成熟有色素的烟曲霉泡子表面可见多量棘状突起，其无色素突变体抱子表层光滑，这种抱子疏水性明显下降，对ECM黏附能力明显下降，同时对氧化剂敏感，对鼠侵袭力下降。由上可见，真菌依靠其特有的分子结构与特定宿主组织发生黏附，黏附在疾病的起始及扩散中起重要作用。通过抑制真菌表面特异性受体或封闭宿主表面配体，破坏真菌疏水性，阻止泡子成熟和棘状化，可以阻止真菌对宿主组织的黏附，从而阻止疾病的发生发展。（三）真菌分泌的酶类与角膜感染的关系研究证实许多真菌在感染宿主的过程中，通过分泌一些特异性酶降解破坏宿主细胞膜成分以利侵袭扩散，病原性真

10、菌分泌的酶类是构成其侵袭力的重要部分，可分为两大类：降解磷脂的磷脂酶和降解肽类的蛋白酶。GhannoumMA提出分泌酶类可认为是致病性真菌（例如白色念珠菌）的完整的发病机理，说明酶类在白色念珠菌致病过程中发挥重要作用。其中主要为蛋白酶、磷脂酶。1 .磷脂酶在白色念珠菌、曲霉菌发病机理中的研究磷脂酶在致病真菌的形态转换和毒力方面起重要作用。磷脂酶D在真菌形态转换过程中激活。现在已知磷脂酶B是白色念珠菌的毒力因素。近来研究证明在白色念珠菌、曲霉菌致病过程中细胞外磷脂酶作为一潜在的毒力因素而存在。Gha-nnoum的实验表明磷脂酶在白色念珠菌及烟曲霉菌的致病过程中起作用。他们克隆了编码念珠菌磷脂酶的

11、三个基因：CaPLB1,CaPLB2,PLDo利用基因干扰的方法，建立了不能分泌磷脂酶B（磷脂酶B由caPLBl编码）的白色念珠菌基因突变株。患有念珠菌病的小鼠动物模型实验性研究中，磷脂酶B缺失株导致念珠菌的毒力降低,表明磷脂酶B对于念珠菌的毒力是必需的。2 .基质金属蛋白酶在真菌性角膜溃疡发病机理中的研究RamakriShna等人在动物实验研究中，以兔子作为研究工具，研究了黄曲霉菌、茄病镰刀菌以胶原作为唯一氮源的时候，在体外产生细胞外蛋白酶的特征。在感染、未感染的兔子角膜中均可见到基质金属蛋白酶2(MMP-2)o在感染的兔子角膜中发现了基质金属蛋白酶9(MMP-9)o酶抑制试验表明体外真菌培

12、养主要是丝氨酸蛋白酶与金属蛋白酶在起作用。在感染的角膜组织中，MMP-9的表达与多形核细胞密切相关，他们推测激活的宿主角膜细胞或炎症细胞很大程度上可能在真菌感染的角膜中有助于蛋白酶活性的增加，从而导致真菌性角膜溃疡中基质的降解。在可溶性胶原或弹性蛋白作为氮源的培养基中生长的时候，真菌产生丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶。因此他们推测胶原酶活动是此提取菌株导致角膜严重破坏的中介物质。综上可知，MMPS在茄病镰刀菌、黄曲霉菌等真菌性角膜炎发病过程中发挥重要作用，而这两种真菌是真菌性角膜炎最常见的致病菌种。因此，充分了解MMPs在真菌性角膜炎中所起的作用对于研究真菌性角膜炎的发病机理非常

13、重要。目前已知MMPs在绿脓杆菌性角膜溃疡的发病过程中MMPs的产生受许多细胞因子调节。当MMPs与MMPs抑制剂的比例倾向于MMPs的时候，胶原基质将过多降解，从而导致溃疡形成。MMPS的作用底物不同，为了避免过多的组织损伤，这些酶受到严密的调节。这些酶生成增多将会损伤角膜，参与角膜上皮损伤与溃疡的病理过程。不同病因引起的角膜溃疡的共同特征是丝氨酸蛋白酶和MMPs的活动失调。这些酶不但参与ECM降解和溃疡形成，而且参与角膜的生理愈合过程。因此，理解这些蛋白水解酶的活动及表达调控机制对于开发阻止疾病发展和促进角膜愈合的新型药物是非常重要的。对蛋白酶在真菌侵袭过程中的作用尚有争议。对人及动物烟曲

14、霉性肺病的组织病理学研究显示，未见明显的与真菌侵袭有关的基质胶原、弹性蛋白及血管壁蛋白的降解，推测菌丝通过机械作用穿透组织。但亦有作者认为可能蛋白酶（ALP、PEP）仅分布于生长菌丝的顶端，从而只在局部降解破坏组织蛋白，尚有待于进一步精确定位研究。总之，尚无确切证据表明蛋白酶在真菌感染组织时扮演重要角色，有可能其作用在于使真菌能降解坏死组织作为营养物质从而与其他腐生菌竞争。3 .黑色素已发现多种菌株如曲霉菌、新型隐球菌、巴西芽生菌均可产生黑色素或黑色素样化合物，研究表明黑色素的合成与真菌毒力密切相关，通过黑色素合成酶基因突变产生的数种真菌白化株对小鼠侵袭力下降。烟曲霉产生灰绿色抱子,Jahn证

15、实其抱子色素缺失株表面光滑，易被宿主的防御机制如氧化剂、单核细胞所杀灭，与野生型相比，此突变株对鼠的侵袭力下降。黑色素是一种强效自由基清除剂，研究表明黑色素主要作用机制为保护抱子逃避机体免疫防御系统，如补体C3介导的调理作用、中性粒细胞介导的吞噬作用和氧化系统，从而延长菌株体内存活时间。抑制黑色素的合成可以破坏其逃逸作用从而起到杀菌的作用，临床上应用较广的三嗖类药物即可通过抑制黑色素的合成减慢真菌的侵袭速率。除了上述有相对普遍意义的毒力因子外，各种病原性真菌都有其特有的侵袭方式，如酵母菌的表型转换、曲霉菌的毒素均被证实在其发病机制中起一定作用。多种真菌毒力因子的共同作用引起真菌感染的发生发展。

16、由于真菌感染的发生是由多种真菌毒力因子的共同作用引起，目前常用单个毒力基因分离突变方法不能完全了解真菌侵袭的总体机制，对与发病有关的毒力基因群的调控基因的研究有望进一步明确真菌感染的发病机制。五、感染角膜的途径真菌感染角膜有3种途径：(1)源性：常有植物、泥土外伤史。(2)附属器的感染漫延。(3)内源性：身体其他部位深部真菌感染，血行扩散,大多数。学者认为真菌是一种条件致病菌，因为正常结膜囊内培养出真菌，检查阳性率高达27%,但不发病，只有长期使用抗生素，致结膜囊内菌群失调或长期应用糖皮质激素，使局部免疫力低下或角膜的外伤等情况下，才引起真菌性角膜炎。六、常见的致病真菌有丝状菌包括镰刀、曲霉和青霉菌，酵母菌常见为白色念珠菌，有学者的研究资料表明，造成山东地区真菌性角膜炎的80%为镰刀菌。(一)镰刀菌在培养的条件下，镰刀菌菌落呈绒毛状或棉团样，白色或淡紫色。气生菌丝