第04章 蛋白质的共价结构.ppt

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1、第三节第三节 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构(一级结构）一级结构）一一 肽与肽键的结构肽与肽键的结构二二 肽的物理和化学性质肽的物理和化学性质三三 天然存在的活性肽天然存在的活性肽四四 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定5 5 蛋白质的一级结构与生物功能蛋白质的一级结构与生物功能一级结构一级结构:多肽链的氨基酸序列多肽链的氨基酸序列 基本要求基本要求1.1.肽的结构特点、基本性质肽的结构特点、基本性质2.2.蛋白质一级结构测定方法蛋白质一级结构测定方法3.3.一级结构与生物功能关系，有关典型例子一级结构与生物功能关系，有关典型例子一一 肽与肽键的结构：肽与肽键的结构：1.1.肽肽（pe

2、ptide）：aaaa的线性聚合物的线性聚合物,也称肽链。也称肽链。2.2.肽键肽键（peptide bond）：连接多肽链主链中氨基：连接多肽链主链中氨基 酸残基共价键酸残基共价键3.3.二肽二肽：2 2个个aaaa以肽键相连以肽键相连4.4.寡肽寡肽(oligopeptide)：含几个到十几个：含几个到十几个aaaa的肽链的肽链5.5.多肽多肽(polypeptide)：含：含2020个以上个以上aaaa的肽链的肽链6.6.环肽环肽一一 肽与肽键的结构：肽与肽键的结构：7.7.氨基酸残基氨基酸残基（amino acid residues）8.8.肽链的极性肽链的极性 N-N-端（左）、端（

3、左）、C-C-端（右）端（右）多肽链的一端含有一个游离的多肽链的一端含有一个游离的氨基，称为氨基端或氨基，称为氨基端或N-N-端。端。另一端含有一个游离的另一端含有一个游离的羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。氨基酸序列是从氨基酸序列是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸残端氨基酸残基为终点的排列顺序。基为终点的排列顺序。9.9.肽基肽基 (peptide group):也称肽单位也称肽单位,肽链中的酰氨基肽链中的酰氨基 (-CO-NH-)(-CO-NH-)（酰氨键）（酰氨键）肽键：肽键：AAAA间脱水后形成的共价间脱水后形成的共价键键N-端端

4、C-端端肽的命名肽的命名 Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser?肽甘氨酸残基甘氨酸残基主干链主干链:N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C肽肽肽链极性肽链极性 由由COCO和和NHNH构成肽键的四个原子和与之相连的两个构成肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子构成的刚性平面碳原子构成的刚性平面肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。肽平面的形成肽平面的形成 见见p164图图42肽键的肽键的C C和和N N均为均为spsp2 2杂化，杂化

5、，有部分双键的性质，相关的有部分双键的性质，相关的6 6个原子处于共平面个原子处于共平面 肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。肽平面的形成肽平面的形成 见见p164p164图图4-24-2 HCCNCO肽平面结构特征肽平面结构特征:肽键长肽键长=1.33A，具部分，具部分 双键性质，不能自由旋转双键性质，不能自由旋转 肽平面上的六个原子肽平面上的六个原子 倾向于共平面，因此肽平面具有刚性倾向于共平面，因此肽平面具有刚性 在肽平面中在肽平面中C=O与与NH 或两个或两个C 呈反式排布。呈反式排布。除除Pro外，外，NC（）和）和C C（）都是单键，可以）都是单键，可以

6、绕键轴自由旋转，其旋转角度分别用绕键轴自由旋转，其旋转角度分别用 和和 表示，称表示，称为二面角（为二面角（dihedral angle）NCOHCC 115.6 121.9 123.2 119.5 肽平面示意图肽平面示意图肽平面：肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。也称肽基平面、酰胺平面。肽键的平面性质在肽链折叠成三维结构中是很重肽键的平面性质在肽链折叠成三维结构中是很重要的。要的。（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质1 1 酸碱性：酸碱性：肽链中末端肽链中末端-羧基的羧基的p pK Ka a值比游离氨基酸中的值比游离氨基酸中的大；末端大；末端-氨基的氨基的p pK Ka a值比游离氨基酸中的小

7、。值比游离氨基酸中的小。肽的肽的等电点等电点计算需先分别判断各解离基团的带计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，电荷情况，再统计净电荷的量（再统计净电荷的量（P166P166表表4-64-6）。）。（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质2 2.化学反应化学反应:化学反应与氨基酸类似化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存，同时，由于肽键的存在在,肽可以进行肽可以进行双缩脲反应。双缩脲反应。茚三酮反应茚三酮反应:双缩脲反应：双缩脲反应：（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质2 2.化学反应化学反应:双缩脲双缩脲（H2NOCNHCONH2）（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质2 2.化学反应化学反应

8、:双缩脲双缩脲双缩脲与铜离子的络合物双缩脲与铜离子的络合物双缩脲在碱性溶液（双缩脲在碱性溶液（NaOHNaOH）中，能与铜离子（）中，能与铜离子（CuCu2+2+）作用，形成紫色络合物，该反应即双缩脲反应。作用，形成紫色络合物，该反应即双缩脲反应。第四章第四章 蛋白质结构蛋白质结构（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质2 2.化学反应化学反应:由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应多肽或蛋白质与铜离多肽或蛋白质与铜离子的络合物部分结构子的络合物

9、部分结构（二）（二）肽的理化性质肽的理化性质 3 3 旋光性质旋光性质：小肽：各氨基酸旋光度之和小肽：各氨基酸旋光度之和 长肽和蛋白：不是简单加和长肽和蛋白：不是简单加和（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素实例：短杆菌肽（抗生素）实例：短杆菌肽（抗生素）谷胱甘肽：谷胱甘肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 GSHGSH（还原型）：三肽（还原型）：三肽 GSSGGSSG（氧化型）：六肽（氧化型）：六肽 脑啡肽：五肽，神经系统脑啡肽：五肽，神经系统 鹅膏蕈碱：环八肽鹅膏蕈碱：环八肽 鹅肌肽（鹅肌肽（-Ala-

10、1-Ala-1-甲基甲基-his)-his)二肽二肽 肌肽（肌肽（-Ala-his)-Ala-his)二肽二肽（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构GSH（还原型）（还原型）三肽三肽GSSG（氧化型）（氧化型）六肽六肽Glu-Cys-Gly|S|S|Glu-Cys-Gly解毒作用解毒作用 与毒物或药物结合，消除毒性与毒物或药物结合，消除毒性参与氧化还原反应参与氧化还原反应保护巯基酶的活性保护巯

11、基酶的活性 使巯基酶的活性基团使巯基酶的活性基团-SH-SH维持还原状态维持还原状态维持红细胞膜结构的稳定维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用H3N+CH C N CH C O CH3COO-CH2OOCH2H阿斯巴甜阿斯巴甜AspartameAspartame天冬酰胺苯丙氨酸甲酯天冬酰胺苯丙氨酸甲酯一种比蔗糖甜一种比蔗糖甜200200倍的甜味剂倍的甜味剂+H H3 3N-N-Tyr-Gly-Gly-PheTyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-Met-COO-Met-脑啡肽脑啡肽 +H H3 3N-N-Tyr-Gly-G

12、ly-PheTyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-Leu-COO-Leu-脑啡肽脑啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催产素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加压素*均为均为9 9肽，仅肽，仅2 2个氨个氨基酸有差别，生理基酸有差别，生理功能差别极大。功能差别极大。|抗革兰氏阳性菌抗革兰氏阳性菌|治疗化脓性病症治疗化脓性病症n蛋白质蛋白质 氨基酸残基数在氨基酸残基数在5050个以上，具有特定空间结构的肽。个以上，具有特定空间结构的肽。n多肽多肽 氨基酸残基数在氨基酸残基数在5050个以下，无特定空间结构的肽。个

13、以下，无特定空间结构的肽。蛋白质与多肽的区别蛋白质与多肽的区别三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定测定的战略：测定的战略：片段重叠法片段重叠法1.一级结构是研究高级结构的基础；一级结构是研究高级结构的基础；2.从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系；从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系；3.为生物进化理论提供依据；为生物进化理论提供依据；4.为人工合成蛋白质提供参考。为人工合成蛋白质提供参考。测定蛋白质一级结构的主要意义：测定蛋白质一级结构的主要意义：二硫键的数目和位置二硫键的数目和位置蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 (Primary structure)(Primary st

14、ructure)组成蛋白质的多肽链数目组成蛋白质的多肽链数目多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序1 测定多肽链的数目测定多肽链的数目2 拆分多肽链拆分多肽链3 断开多肽链内的二断开多肽链内的二 硫键硫键4 测定每一肽链的氨测定每一肽链的氨 基酸组成基酸组成5 鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端末端6 裂解多肽链为较小的肽段裂解多肽链为较小的肽段7 测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列8 重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构9 确定二硫键的位置确定二硫键的位置相对分子量的确定相对分子量的确定待测样品纯度鉴定待测样品纯度鉴定97以上以上准备工作准备工作(一一)策略

15、策略准备工作（一）：准备工作（一）：样品的分离纯化和纯度鉴定样品的分离纯化和纯度鉴定 纯度纯度97%97%检测蛋白质样品检测蛋白质样品纯度纯度的方法：的方法：（1 1）电泳）电泳 （2 2）层析）层析 （3 3）N-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定 （4 4）等电点沉淀）等电点沉淀 （5 5）纯化至恒定的比活）纯化至恒定的比活准备工作（二）：准备工作（二）：确定相对分子量确定相对分子量 误差误差97%97%B.B.分子量分子量C.C.亚基数量亚基数量D.D.测定氨基酸组成；测定氨基酸组成；计算每种氨基酸的个数计算每种氨基酸的个数E.E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量测定水解液中的氨量，计算

16、酰胺的含量1 1、测定蛋白质分子中多肽链的数目、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定测定末端末端AAAA的的摩尔数摩尔数与蛋白质与蛋白质分子量分子量之间的之间的关系关系确定多肽链的数目确定多肽链的数目（二）测定步骤（二）测定步骤2 2、多肽链的拆分、多肽链的拆分 多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分2.多肽链的拆离多肽链的拆离 P171 1).亚基拆分亚基拆分:PH改变改变:PH10;PH3 强变性剂：脲强变性剂：脲（8M）；）；盐酸胍（盐酸胍（6M）高浓盐高浓盐 2).二硫键拆分二硫键拆分 氧化氧化:过甲酸过甲酸，不再重新生成，不再重新生成-S-S-还原还原:DTT；巯基乙醇；巯基乙醇 加碘乙酸等加碘乙酸等烷基化试剂烷基化试剂封闭封闭SH 烷基化试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺烷基化试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺 3).肽链分离和鉴定肽链分离和鉴定 分离分离:层析层析 电泳电泳 鉴定鉴定:SDS-PAGE；N-末端分析末端分析 寡聚蛋白质：寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接多肽链以非共价键连接血红蛋白血红蛋白（四聚体）、（四聚体）、烯醇化酶烯醇化酶