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1、1.实验目的2.实验原理 3.实验仪器、材料与试剂 4.实验步骤 5.实验结果及讨论 l限制性内切酶切割出目的DNAl了解琼脂糖凝胶电泳的原理l掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法 l利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点,定点切割环状质粒DNA。l琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法,它能检测少量的DNA(如用肉眼观察,可检测到10 ng的DNA),且检测的范围很广。pBC SK mappBC SK mapl它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时,溴化乙锭从正极向负极移动,这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物,使DNA在紫
2、外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下,荧光的强度正比于DNA的含量,这样就可以检测DNA的浓度。(一)仪器 l1.水平式凝胶电泳槽 l2.稳压电泳仪 l3.电炉 l4.紫外检测仪 l5.台式离心机(二)材料 l实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。(三)(三)试剂试剂 l1.限制性内切酶 EcoRI,l2.TAE电泳缓冲液(50)(pH8.0)Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ml l3.溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液,室温,棕色瓶或铝铂纸包装保存。l4.10DNA样品上样缓冲液 l5.琼脂糖酶切体系l调制酶切体系如下:
3、(共 20L)无菌水 6L,质粒 10 L Buffer K 2L,EcoR I 1L,BamH I 1 L 37酶切1.5小时。l1.洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板,晾干。l2.插好挡板、梳子。l3.根据实验所需称取0.4克琼脂糖,放入制胶 的容器中(一般用三角瓶),然后加入40ml电泳缓冲液(1TAE)。l4.加热煮沸,使琼脂糖完全完全溶解。l5.溶液冷至约60时,加入溴化乙锭4 L(终浓度为0.1 g/l),轻轻摇匀,倒入制胶槽上,检查有无气泡。l6.室温下约30-45分钟后,琼脂糖溶液完全凝固,小心垂直拔出梳子和挡板,清除碎胶,将凝胶放入电泳槽中。l7.加入电泳缓冲液(1TAE)至电泳
4、槽中,使液面高于胶面约1mm。l 8.在DNA样品中加入2 L(1/10体积)的10 DNA上样缓冲液(loading buffer),混匀,稍甩一下,使溶液都处于离心管底。l9.用移液器吸起离心管中溶液,移入凝胶的梳孔中。l10.插上导线,打开电泳仪电源,按照需要调节电压至120V,电泳开始,观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。l11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后,将电压(或电流)回零,关闭电源,停止电泳。l12.取出凝胶,在紫外观测仪上观察电泳结果。l13.根据需要切下DNA条带,放入1.5ml Ep管中,放于4保存,以备下周实验用。l质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带,最前面的条带为超螺旋构型,中间为线型,最后为单链有缺刻的构型。l如提取过程中有机械损伤,可能在胶上出现弥散。l影响RE(限制性内切酶)活性的主要因素:DNA的纯度;DNA的甲基化程度;温度;缓冲液成分(DDT,BSA)等。使用3 mg的DNA Marker DL2,000(500 ng/条带)进行1%的琼脂糖凝胶电泳后,各DNA条带自上至下分别为2kb,1Kb,750bp,500bp,250bp,100bp。