尿液有机酸气相色谱-质谱联用检测方法通则.docx

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1、ICSxx.xxx.xxXXX团体标准T/CRHAXXX-XXXX尿液有机酸气相色谱-质谱联用检测方法通则Methodofdetectingorganicacidsinurinebygaschromatography-massspectrometry（征求意见稿）XXXX-XX-XX 实施XXXX-XX-XX发布中国研究型医院学会发布目次前言Il1范围12规范性引用文件13术语和定义14缩略语25检测原理26检测技术指标27样本检测要求38样本检测方法4附录A（资料性附录）尿液有机酸气相色谱-质谱联用检测配套通用试剂8附录B（资料性附录）尿有机酸GCMS检测预处理程序9本文件按照GB/T1.1

2、-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。考虑到本文件中的某些条款可能涉及专利，中国研究型医院学会不负责对任何该类专利的鉴别。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：XXXo本文件主要起草人：XXXo尿液有机酸气相色谱-质谱联用检测方法1范围本文件规定了使用气相色谱-质谱联用技术进行尿液中有机酸检测方法的术语和定义、缩略语、检测原理、试剂和材料、仪器和设备、检测方法、检测报告。本文件适用于应用气相色谱-质谱联用仪器对尿液中内源性小分子代谢产物有机酸的检测。2范性引用文件本文件参考并规范性引用美国

3、医学遗传学和基因组学会(ACMG)临床遗传学实验室标准和指南、CLIA法规、强制性国标(GB)、卫生组织推荐标准(WS/T)等。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6041-2020质谱分析方法通则GB/T32267-2015分析仪器性能测定术语GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T32264-2015气相色谱-单四极质谱仪性能测定方法GB/T29791.3-2013体外诊断医疗器械制造商提供的信息标示GB/T33864-2017质谱仪通用规范GB/T26124-2011临床化学

4、体外诊断试剂(盒)GB/T19702-2005体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量参考测量程序的说明CNAS-GLO37临床化学定量检验程序性能验证指南YY/T1244-2014体外诊断试剂用纯化水WSZT408-2012临床化学设备线性评价指南WSZT416-2013干扰实验指南WS/T420-2013临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证WSZT492-2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1气相色谱-质谱联用仪gaschromatographymassspectrometer(GCMS)一种结合气相色谱和质谱特性的分析仪器,鉴别

5、与测定待检样本中不同物质,应用于医学、物理学、食品安全、环境监测等领域。3.2质荷比mass-to-chargeratio(mz)带电离子的质量与所带电荷之比值，以mz表示。3.3质量范围massrange仪器所能测量的离子质量范围，单位为amu(AtomicMassUnit)O3. 4质量分辨率massresolution分辨两个相邻质谱峰的能力，相邻两个质谱峰，其峰谷不大于峰高的10%时，定义为可以区分。3.5质量准确性massaccuracy测定离子的质荷比与实际(理论)质荷比的偏离程度。3.6半峰宽fulIwidthathaIfmaximum(FWHM)质谱峰峰高一半处的峰宽度(W“2

6、)表示，简称半峰宽,单位为U。3.7线性Iinearity在检测样本时，可以直接按比例得出分析物含量(一定范围内)的能力。3.8线性范围Iinerrange指覆盖检测系统可接受线性关系的范围，非线性误差小于设定标准。3.9干扰interference在混合样品中分析一个组分时，影响分析结果准确性的因素。3. 10信噪比signaItonoiseratio(SN)被测物信号强度与该检测条件下基线噪声的比值。4. 11检测限Iimitofdetection(LOD)又称为检出限，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。这一指标只能用

7、于限度检查，而不能用于报告定量结果。5. 12定量限LimitofQuantitation(LOQ)样本中被测物质定量测定的最低量(也是成线性范围的最低浓度或量)，其测定结果应符合准确度和精密度要求。可衡量方法灵敏度与定量检测能力。常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比(S/N)为10:1时相应的浓度或注入仪器的量确定定量限。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Tle:总离子流图(totalionchromatogram)SIM：选择离子扫描(SeleCledionmOniloring)OA：有机酸(organicacid)AA：氨基酸(aminoacid)GC：气相色谱(gaschromatogr

8、aphy)MS：质谱仪(massspectrometer)EI：电子电离(electronionization)1.OQ：定量限(limitofquantitation)1.OD：检测限（limitofdetection）RSD：相对标准偏差（relativestandarddeviation）5分析原理5.1 GCMS检测原理采用含内标的样本萃取液对尿液或尿滤纸片中的有机酸进行萃取，提取物经衍生化后复溶用GCMS仪进行分析。GCMS由气相色谱仪和单级四极杆质谱仪两个部分组成，利用气相色谱仪的分离能力对尿中多种有机酸代谢物有效分离后，再通过质谱部分鉴定分离的组分（定性），使用GSMS数据库检索

9、系统进行数据分析。基于内标标准曲线定量计算出各检测指标相应含量，同时测定尿液或尿滤纸片的肌酎含量,以mmol/LmmolCr为单位。5.2 校准尿有机酸分析需采用至少两种以上的标准物质作为内标，内标的选择因实验室而异，但内标必须是不存在于人体样本中，并且可以通过气相色谱法与其他化合物分离的可识别物质。内标一是用于评价提取效率,并将患者样本中的代谢物浓度与校准标准进行直接比较。常用的内标包括十七酸、2-苯基丁酸、托品酸、2-酮基己酸、对氯苯甲酸和二甲基丙二酸等。内标二在衍生化之前（也可在样本提取时）加入，用于评价仪器状态与衍生化程度，通常采用二十四烷作为第二种内标。5.3 定量尿有机酸浓度的定量

10、尽可能通过内标标准曲线法完成。为程序中定量的每个分析物准备校准曲线,校准曲线线性范围必须涵盖人体正常范围和目标疾病阳性浓度范围。校准曲线系列溶液应包括定量有机酸的至少5个以上浓度梯度以及加入已知量的内标物。在待测物中加入与标准曲线相同量的内标物，可以使用化合物的单个定量离子进行定量，计算目标化合物与内标的峰面积比，然后使用校准曲线斜率（相对校正因子）获得定量结果。不建议在不使用特定参考标准的情况下进行定量。6定量检测技术指标1.1 线性评估线性时至少要求五个不同浓度水平样本，每个浓度水平重复测定3次，分析结果做回归分析，一元线性回归曲线，R20.9900o1.2 线性范围标准曲线应覆盖样品可能

11、的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120%,下限为样品最低浓度的80%（但应高于LoQ）。1.3 精密度在规定条件下所获得独立检测结果的接近程度，用测定6次结果进行相对标准偏差（RSD）评价。1.4 准确度采用标准物质进行对照试验，在无标准物质或标准方法时，常用加入被测组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。两个及以上浓度样本检测回收率在80%120%以内。1.5 重复性即检测结果的重复性，在相同检测条件下对同一待测物进行连续多次测量所得结果的一致性。在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。1.6 定量限定量限应不大于报告范围的最低浓度，定量限确定一定要是连续进样，

12、通常建议平行测定6次（因其要符合准确度和精密度要求），且6针信噪比（S/N）均要l（kl.1.7 分析灵敏度全扫描灵敏度（电子轰击源EI）：IPg八氟蔡，信/躁比（S/N）200:1;选择离子扫描灵敏度（电子轰击源ED：20fg八氟蔡，信/噪比（S/N）10lo1.8 患者结果可报告范围测量仪器的误差在特定范围内的一系列分析物的测量结果，计算测定值与预期值比值R,取80%R120%的浓度范围为可报告范围。6. 9参考范围每个实验室应根据其使用方法建立参考范围，并定期验证所有报告的定量化合物的参考范围，参考范围应利用内源肌酎浓度进行归一化。当使用基于文献报道的参考范围时，必须定期验证。7半定量检

13、测技术指标国内大部分实验室已经建立了尿液有机酸代谢谱库，并通过有机酸代谢物特征离子与内标峰面积比值进行半定量测定。正常人尿液中，有机酸指标的含量与肌酸酎含量之比有固定的数值范围，因此,有实验室以人尿液中排泄量较为稳定的肌酸酎作为内标，用有机酸特征离子的质谱色谱峰面积与肌酸酎特征离子的质谱色谱峰面积比值作为半定量结果。也有以较为稳定的内标（如托品酸、十七烷酸）进行半定量分析。每个实验室根据所采用的的方法建立相应的本地化参考区间。8样本分析要求6.1 样本要求7. 1.1尿液推荐使用原始尿液进行检测，建议采集量26mlo新鲜尿液应收集在不含防腐剂的干净容器中，尽快冷冻，并冷冻保存直至分析。未冷冻尿

14、样，低温冷藏（28）保存不宜超过4小时。如果尿液样本出现以下任一情况将视为不合格：a）无检测申请单或检测申请单内容与样本信息不符；b）容器有破损：管壁有裂缝或开盖、盖子未盖紧等；c）样本量不足：尿量小于2mL；d）没有及时寄送的样本，未采取冷藏（2C8C）或冷冻保存；e）样本递送未采取冷链运输，冻存样本融化。7. 1.2干尿滤纸片无冷藏、冷冻条件的可制作干尿源纸片。制作过程参考如下：（1）使用2片新华3号滤纸（4cmX4cm）完全浸透于尿液中；（2）浸泡时间215min,于干燥阴凉避光处晾干，自封袋密封保存；（3）及时常温快递或冷链运送。如果干尿滥纸片样本出现以下任一情况将视为不合格：a）无检

15、测申请单或检测申请单内容与样本信息不符；b）放置时间过长：样本自采集至晾干超过1天。自制作完成至到达实验室超过20天；c）样本潮湿、发霉，有笔迹黑点等污染（晾干过程尿流纸片最好悬空不与物体接触，若必须接触应保证接触物干净无污染）；d）样本非自然晾干（推荐晾干方式：室温下放置约24小时自然干燥）；严禁将尿滤纸片放置于如电吹风、暖气、电炉、阳光及强光灯等热源下烘烤；e）样本量不足：尿滤纸片少于2张或者尿滤纸片载尿时未完全浸透仅负载少量尿样，实际复溶出的尿液不满足实验用量）。2、7.1.3采集时机及长期保存采集随机尿液，无需晨尿。采集前避免短时间内大量饮水、服药。如果患者出现疑似疾病急性发作（或失代偿），推荐采集急性（失代偿）期尿样。因为在目标疾病急性期尿液中的诊断标志物浓度最高，利于疾病的检出和鉴别。尿液或滤纸片送至实验室后，应保存在-20或更低温度，尽快完成检测。完成检测后的样本推荐在-20C冷冻保存3年，以备复测。8.2检测试剂与材料a）检测用纯化水：检测用纯化水应符合YY/T1244-2014要求；b）尿素酶：尿素分解试剂，用于样本