羟甲基戊二酰辅酶A合成酶HMGCS试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGCS）试剂盒说明书微量法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：羟甲基戊二酰辅酶A合成函是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoAo渊定原理：HMGCS催化乙酰COA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,同时产生CoASH,使DTNB转化为黄色的TNB,在412nm下有特征吸光值。所需的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：提取液：10OmLXl瓶，4保存；试剂一：粉剂Xl瓶，-20C避光保存；

2、临用前加入3mL蒸储水充分溶解待用；用不完的试剂分装后2（C保存，禁止反复冻融；试剂二：粉剂Xl瓶，20C避光保存；临用前加入3mL蒸憎水充分溶解待用；用不完的试剂分装后2（C保存，禁止反复冻融；试剂三：6mLl瓶，4避光保存。样本渊定的准备：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）；8000g4C离心IOmin,取上清，置冰上待测。组织：按照

3、组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4已离心IOmin,取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。渊定步Wh1、分光光度计或衡标仪预热30min以上，调节波长至412nm,蒸储水调零。2、在微量石英比色皿或96孔板中加入25L试剂一、25L试剂二和50L试剂三，混匀，加入100L样本上清，迅速混匀后记录412nm卜.初始吸光值Al和4min后的吸光值A2。计算AA=A2-A10HMGCS活性计算：用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清(浆)活性单位定义：每mL血清(浆)每分钟催化产生InmolTN

4、B为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/mL)=AAV反总(d)l4v样T=36.76A2、组织、细菌或细胞HMGCS活性(1)按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmolTNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/minmgproi)=AAxV反总(d)xlO(V样XCPr)T=36.76AACpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生InmoITNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/g鲜重)=AAV反总(d)109(WXV样V样总)T=36.76AW(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生InmoIT

5、NB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/IO4cel)=AAXV反总(d)109(50OXV样V样总)T=0.074AV反总:反应体系总体积,2i4L;:TNB摩尔消光系数，1.361O4L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，4min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。用96孔板测定的计算公式如下1、血清(浆)活性单位定义：每mL血清(浆)每分钟催化产生InmolTNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/mL)=AAV反总(d)xl*v

6、样T=73.53A2、组织、细菌或细胞HMGCS活性(1)按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmolTNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/minmgproi)=AAV反总(d)l04(v样XCPr)T=73.53AACpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生InmoITNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/g鲜重)=AAV反总(d)109(WXV样V样总)T=73.53AW(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生InmoITNB为一个酶活力单位。HMGCS(nmol/min/IO4cel)=AAxV反总(d)109(5(X)XV样V样总)T=0.147AV反总:反应体系总体积,2104L;:TNB摩尔消光系数，1.36x10。L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1mL：V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，4min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。