植物组织培养.docx

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1、植物组织培养一、原理植物组织培养是指在无菌条件下,对离体植物组织(器官或细胞)分离并在培养基中培养,使其能够继续生长,甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性,即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组,因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞,一旦脱离原有的机体环境,成为离体状态,在适宜的营养和外界条件下,就会表现出全能性,从已经分化定型的细胞,脱分化,成为恢复分裂能力的细胞,并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞,通过脱分化不断分裂、增生子细胞,这些细胞胞分裂快,构造疏松,颜色浅而透明,

2、逐渐形成了无序构造的一团细胞。二、试剂及仪器(一)仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器(l-5nd)、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶(500mh100ml).量筒、烧杯(1000ml)、试剂瓶(Iooon11、100ml)、长镶子、记号笔(或标签纸)、培养皿、酒精灯、打孔器(二)试剂75%酒精、次氯酸钠(或H202)、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCLNaOH,KH2P04.CoC12?6H20、烟酸、盐酸-硫胺素(VB1)、盐酸-叱哆醇(VB6)、肌醇、甘氨酸三、实验步骤(一)培养基配制L培养基的选择植物组织培养中应用的培

3、养基,一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素:C、H、0、N、P、S、K、Ca.Na、Mg等,微量元素:Mn、Zn、Cu.B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的,而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA(呻味乙酸)、IBA(呻味-3-丁酸)、NAA(蔡乙酸)、NOA(蔡氧乙酸)、P-CPA(对氯苯氧乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸);BAP(羊氨基喋吟)、6-BA(羊基腺喋吟)、2-Zi(异戊烯氨基喋吟)、KT(激动素)等。有机附加物是指甘

4、氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等,可促进分化,但如培养基配方适当,则大多数组织是不需要的。培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育,故应根据培养植物的种类和部位,选择适宜的培养基。培养基种类繁多,最基本、最常用的培养基为MS培养基(见表1)。2.培养基的配制先按表1配制MS培养基贮液,再将贮液与其他成分按比例混合。此外还需参加适量的蔗糖作为碳源,起支持作用的琼脂粉,适量的生长调节剂等。将上述培养基加热溶解后,加蒸偏水使培养基到达终体积。再用0.Imol/LNaOH或0.lmolLHCl调节培养基的pH值至最适。分装至三角烧瓶,封口膜封口,等待灭菌后使用。3.几种诱导愈伤组织的培养基胡萝卜MS+

5、0.5mgL6BA+0.5mgLNAA玫瑰叶盘,芽MS+0.5mgL6BA+0.5mgLNAA烟草叶盘、叶柄MS+O.lmgL6BA+0.5mgLNAApH5.8,蔗糖30%,琼脂粉6.5gLo(二)灭菌1.培养基及器具灭菌培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度,常用的灭菌温度为12UC,所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化(见表2)灭菌完毕后待温度下降到50。C以下,才能取出已灭菌的培养基。可用同样方法对器具同时开展灭菌,包括:培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镶子、打孔器等。2.工作环境灭菌接种前Ih打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40mino杀菌完毕后,先关掉棚面的紫外灯,再打开风机,最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时,要先打开台面的紫外灯,再关风机,最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。3.植物材料的灭菌植株各部分的表面携带着各种微生物,他们是植物组培的污染源,所以在接种培养前必须开展彻底的表面消毒;组织内部侵染的真菌或细菌很难消除,这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢,再用无菌洁净滤纸吸干水分。推荐阅读:轻松自制精美花盆九月二日:秋麒麟草多年生草本植物毛地黄螃虫的防治及综合介绍

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