巴勒斯坦侧金盏花斑枯病病原菌Phoma adonidicola 的特性研究.docx

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1、外文题目：巴勒斯坦例金盏花斑枯病病原菌Phomaadonidico1.a的特性研究巴初斯坦侧金或花是产生红色虾再素的三大天然来源之一.好巧素不仅是有抗氧化功能价值的食物.也是饲养陛鱼的食物添加剂.自2004年以来,一种枯萎病的发生对中国内徵古地区的巴勃斯坦侧金盘花造成极大伤害.病害在寄主植物的叶柄、茎部引起褐色小病斑.发病初期,田间拉物近胞部分产生粉色病现，奴终扩展至整个植株，使其叶片全部脱落,从病部分离所御口倒，按其形态特征签定为P1.uwa*根据1.SU、ITS以及TUB系统发方树分析，P.adonidico1.a与SWgawMwm/Mis咏CiS所在的分支有良好的一致性.P.“而所die

2、幻的所7J菌株使接种后的植物出现典型筑班，井能从病斑组线再次成功分离。这种病古命名为巴勒斯坦侧金或花瓶枯病。知词：班枯病；科赫氏法则；巴勒斯坦侧金蛊花；多基因分析1 .前言巴勒斯坦储金靛花(毛茂科)是二倍体一年生草本植物，源于巴勒斯坦，以色列，黎巴嫩，约旦和叙利亚，含有丰富的虾吉素，尤其是在蚌红色花瓣中。(Wang1.994:RaytOncta1.2006)红色的虾青素不仅是保健品行业中强劲的抗氧化剂(FassettandCoOmbeS2009:Higuera-Ciaparaeta1.2006:Pashkoweta1.2008),也是水产养殖业中鱼的食品添加剂,因为它赋予了蛙鱼(例如蛙鱼，鲜鱼

3、)和甲壳类动物(例如虾)令人满诲的粉色。(Rayioncta1.2OO6:Seybo1.dandGoodwin1959)商业颜料主要通过化学方法合成，部分从某些天然成分提取,如甲壳类动物，红发夫酵母和绿藻雨生红球濠。从巴勒斯坦侧金黑花中提取虾音素经济实惠，既避免r化学污染又减少r副产物的积累，这就是植物自然资源的宝贵之处。2004年中国内蒙古地区引进巴勒斯坦储金盏花，通过大量繁殖来生产虾青素。2(X)4年更大在中国内蒙古通辽地区进行植物病害田间调查期间，发现使巴勒斯坦IW金盏花的叶片、叶柄及茎部产生斑点的病击。这些斑点通常相互联合造成地上组织枯萎，推测可能与真菌/“OM。，应生H”相关。自发现

4、以来，病害严重时可使巴勒斯坦侧金蕊花的产量造成高达60%的损失，直接威胁巴勒斯坦侧金就花的可持续生产.本文针对病原体的特性描述以及建立对疾病的科学防治基础进行研究。2 .材料方法2.1 病原菌的分离随若田间病情的发展，随机从中国内蒙古通辽市五大商业产区选择了五至七株病株。典型症状的茎，根和叶柄在I%次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，然后用无菌蒸储水漂洗三次进行表面消毒。在无菌条件下，从病灶边缘切取约5x5奉米的组织块并置于含有100gm1.1.硫酸链霉素的马铃落福药糖琼脂(PDA)(200克土豆，20g的福萄箴,20g的琼脂/1升蒸懒水).将平板在26-28C黑暗培养.3至5天后，将真菌菌落转移至新鲜

5、的PDA平板上，并在26-28C培养，真菌分离物由单袍纯化，随后转移至PDA斜面在4C保存。纯化的真菌菌落菌丝体于15%甘油冷冻悬浮保存，在80C长期储存。2.2 致病性检测22*C暗培养7天后打取5mm直径菌块接种在燕麦培养基诱导其形成抱子，平板置于近鳌外光，12小时光周期22C培养8天。用5m1.无菌水冲洗平板制备泡了悬浮液。电子收集时用无菌透链擦拭纸过淤也子悬浮液，通过血球计数器统计电子个数并以无菌水调节至5x0t1.个/m1.将巴勒斯坦侧金黑花种子用1%次叙酸钠溶液消南十分钟后接种到经170C干热灭菌2h的土壤：泥炭：蛭石2:1:1混合物的花盆中，嫩叶用来接种.致病性试验是在雷室(22

6、24C,70%RH)下进行。被选定为致病性测定的二十八个真菌菌株性自植物的多个部位(茎，叶柄和根;表1)，地点和生长期。生长期为四个月时，用含有吐温20(0.025%)的抱子悬:浮液均匀喷算至径流“每个实验重组-：次，每次IO株植物，其中对照植物用无菌水喷雾。接种过的幼苗食聚乙烯袋48h以保持潮湿条件，于室内I2h光周期培养。4-8天后计算病害严重程度。植株的病杏严重程度以表面积的感染的百分比为基础。分为0至5个级别，其中0=没有症状,1=病斑面积小于植物表面的10%,2=10-25%,3=2550%,4=50到75%,5=75100%导致植物死亡。病情指数按以下公式计算：DSi=Z(各级病叶

7、数X代表值)调杳总页数X最高病级代表假DSI结果中的0为没有植物被感染，100为所有额定植物感病死亡。用SAS程序对DSI数据进行方差分析。从人工接种的植物上分离的病原菌使植物表现该病的典型症状。2.3 病原菌鉴定Phoma的菌株首先进行形态学鉴定，将菌株接种于燕麦培养基22C培养，近紫外光下12h光周期培养7天。在笫7天跟第14天测定菌落直径、色斑大小以及分生抱子形态，并在OA培养基边绿滴加NaOH观察颜色变化来测定扩散性抗生素代谢物E系统发育分析，12个Phoma真的基因组DNA照FastDNAkit和FastPrcpFP-24的说明书提取.对该DNA序列的三个区城进行分析：1.SU(大亚

8、基-28S),ITS(ITSI-5.8S-ITS2)和TUB(B-微管蛋白)。1.SU区域用引物1.RoR和1.R7进行扩增，ITS区域用引物ITSI和ITS4进行扩增,TUB区域用TUB2Fd和TUB4Rd进行扩增。KR反应在MyCyCIerrM热循环仪中进行,反应体系为501.其组成为51.的EasyTaq缓冲液,41.的dNTPs(2.5亳摩尔)，每种引物各1.1.(10M),HaysTaqDNA聚合萌0.51.(IUpcr501.),10到50纳克的DNA模板，高度纯化的无菌水的3651.0应用在所有的PCR设置中，包括不含DNA的阴性对照。所有三个区域循环参数为95C下5分钟，随后在

9、95C下30秒，退火工序:1.SU为48C45s:ITS在48*C50s:TUB为52t30s,72X72分钟，35个循环，72C7分钟“PCR产物用1%（wv）O.IingZmI的溟化乙锭在1.TAE缓冲液（0.4摩尔Tris,0.05M的醋酸钠，0.0IMEDTA,PH值7.85）的琼脂触凝胶中进行电泳分析，井在紫外光卜,观察。以2KP1.USH（TanSGCn牛.物技术，北京，中国）为标准尺寸。PCR产物的纯化和测序使用北京生物医学有限公司生产的相同的用物组合。序列的组装和编软采用Gap4的STADEN包裹。两侧的模糊区域通过分析排除。序列杳询提交国家生物技术信息中心b1.ast网络服务

10、器。最大荷约（MP）分析使用米加4.0软件个体的基因数据集.为首次执行。一旦拓扑致性在三个数据集中建立，这三个数据集成为包含100O引导程序揖熨在内的关联支路支持的联合数据桀。系统发育分析还包括从GcnBank中获得的由Avcskamp和Vaghcfi等所产生.的数据集。AscochyiaIion1.eiar.hordei（CBS544.74）f1.Phoma1.yasp1.iCBS5M）.8I&CBS56I.81）的序列被用于外群体.3 .结果3.1 病症及菌株分离当日常温度达到2325C,并伴随降水发生时，发病期为五月底或六月初。典型症状表现为植物茎基部和下部接近土壤的叶柄出现小的黄棕色的

11、病变。（图Ia）随着时间的推移，病变逐渐增大，聚结，成为黑褐色坏死，粒盖大部分的茎和叶柄（图1b）.随若植物生长，病斑扩展到植物的上部（图1c）,将病株根纵向解剖,在中央维管组织中观察到深褐色的条蚊（图Id）,随着病情的发展，病株卜部叶片逐渐变成深褐色,并在干旱条件下干燥破裂（图1.e）严重盛染的叶片提前落叶，只留下茎杆（图If）,将病变组织优于含有渔灌纸培养皿中培养，几天后可观察到典型的分生池子器。因此这种疾病被命名为斑枯病。图1.巴勒斯坦侧金金花的田间症状。a,地上部分早期感病的叶柄：b,痫灶功断桢物表面的大部分;c.茎上分散的黄褐色病理：d根纵截面的中央维管组织有标色条纹：c.田间抽签期

12、症状：f.田间后期症状.从野外采集的病害样品中共分离菌株226株“其中148株从病株的茎，叶柄和根中分熟得到，表现出P/?。我的典型形态（图2）。而且，Phomasp.从茎和叶柄中的分离频率最高，其次是根（图2）。包括Phoma在内，从患病组织中获得28株Fusarium.24株P1.eeioswnum,24株A1.temuriu以及2株Co1.1.etotrichiim（图2）。被选定为致病性测定的二十八株（15个Phoma,2个Fusarium,5个P1.ectosporium和2个CMet。MCht小表I）来自不同部位（茎，叶柄或根），地点和生长期。PhQPfeMFusCo1.80(M2

13、8nba1.U1.UOUe1.oS一706050403020100图2.患病巴勃斯坦恻金盏花中分惠出各种真菌的频率.Phoma（Pho）;P1.caosporiumSP（PIe）,A1.ternaria（A1.T）:Fusarium（HJS）;Co1.1.etotrichiun（CO1.）-3.2 致病性检测在巴勒斯坦侧金盏花上，P/s”a所有菌株接种后23天造成典型病珥（表I）,且症状于在田间观察到的类似（图3a）。茎上接种后5-6天观察到分生施子器（K3b）一些接种的植物的根维管组织变成暗棕色。我们还注意到5侏P1.ectosporiumsp引起茎和叶柄上产牛.褐色小病斑（图3c,表I）。

14、然而，从接种植物的这些病变中的分生抱了器与Phoma菌株引发病灶的分生例子潜观察到的外观不同。Fusarium.A1.1.eniaria或Co1.1.etotrkhum的菌株在接种后均不显症，对照植物无病症（表I）。P.A面市市co是从人工接种的植物的病组织重新分离。这些结果表明，Phoma为巴勒斯坦侧金荔花斑枯病的致病菌。图3.接种Phoma或P1.ec1.osporiuni后.巴勒斯坦（1（金盆花的症状.a.引起症状：b.Ruww分生泡子器时植物接种后引起的症状：c,Mama“加，”引起的症状.3.3 病原菌的鉴定基于菌落的生长，色素形成及分生池子，分生胞子器和序垣抱子的特点，所有从巴勒斯

15、坦（W金盏花分离得到的制菌株显示Phomaadomdico1.a的典型特征。P.（Kionidico1.a的形态学鉴定结果由多基因分析进一步证实。被检查侏的1.SUGenBank登记号JQ934854-JQ934865）,ITS（GcnBank登记号JQ93483O-JQ9S484I）或TUB（GenBank登记号JQ934842-JQ934853）序列与S1.agOMsporopsisajacis（M义词ajacis）最为相似，菌株CBS176.93和CBS1.T7.93和S.（同义词RIHe也.e）菌株CBS273.92和CBS392.76。从单个数据集所生成的系统发育树产生.几乎相同的分

16、枝，数据集由包括1.SU：1327；ITS：495：TUB：341在内的2163个碱基组成.其中有1884个（1.SU：1260：ITS：403和TUB：221.）是常量，而剩余279个喊基（1.SU：67；ITS：92；TUB：120）是兼并信息。结合序列系统发育分析表明，所有从中国巴勒斯坦（W金盏花分离得到的P.Ado,Udico1.a与S.ajacis参号株分在组（图4）。这些结果表明，从巴勒斯坦侧金荔花分离的P.Udonidico1.a的闺株是同种的，但于Stagonosporopsis或P1.ioma图4PQkmidieS和箍于1.SU,ITS和TUB的基因组合序列数据的相关品种的邻居接合部树.节点的日分数表示以1000血新来样数据蛆的劄接法分析为甚础