T_CSBM 0046-2024 涂层抗凝血性能体外试验方法.docx

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1、ICS11.040.01T/CSBM团体标准TtCSBM00462024涂层抗凝血性能体外试验方法Testingmethodforanticoagu1.ationpropertiesofcoatinginvitro2024-10-01实施2024-05-14发布中国生物材料学会发布T/CSBM(MM62(I24前言II引古!.!III1蒐围!.!.I2规范性引用文件I3术语和定义I4总则I5试脸方法16报告4参考文献5I.CSRM04694本文件按照GB门-1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的燃定起草.请注意本文件的某些内容UJ能涉及专利.本文件的发布机构不承担

2、识别专利的费仔.本文件由中国生物材料学会提出，本文件伸中国生物材料学会团体标准化技术委员会归口.本文件起草单位：江苏百赛飞生物科技有限公司、百因特表界面检验检测技术（苏州）有限公司、苏州疗大卫生与环境技术研究所有限公司、四川大学、四川医疗器械生物材料和制屈检验中心自限公司、深圳市药品检$金研究院（深圳市医疗器械椅测中心）、山东省医疗器械和药品包装检脸研究院、苏州大学、苏州工业园区生物材料表界面工程研咒院.本文件主要起草人：李丹、陈益平、王丽洁、梁洁.王云兵、袁映、王书喀、刘成虎、方方嶷、陈红”TNSHM46M1.脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称,泛指由于高血脂、动脓粥样硬化、高血压等所导

3、致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。据统计，全世界每年死于心脑血管疾病的人数居各种死因首位,严重成胁着人类的健康及生命安全，随着现代医学的发展，越来越多的血液接触类医疗器械被应用于心脑血管类疾病的治疗，器械在使用过程中往往会因为非生理性血流剪切力.低速流、流动滞止等流动因素和非自体的机械结构因素，血浆中蛋白质首先会蝌间在器械材料表面吸附形成血浆去门层，然后血小板会在血浆蛋白表面粘附、W.迸而使血小板激活、凝血级联及补体激活，最终导致血栓形成。现代医学发展至今，尽管历经数十年的研究与实践.仍未能开发出一种具有持久血液相容性的材料，而材料表面引发的凝血或血栓问题一直是血液相容性问题中

4、最普遍也是最严重的，病人花使用这些器械的过程中,绝大多数情况仍需同步辅以抗凝药物，但即便如此，仍然无法完全避免血栓在材料表面生成，且会增加出血的风除.因此，在材料/器械表面设计及构建安全和有效的抗凝血表面涂层为这一问SS的解决提供了思路，能有效避免材料表面发生凝血和曲栓的形成。然而，国内带抗凝涂层医疗器械的研究和发展刚刚起小，时于抗凝涂层的功能性和安全性评价研究也十分匮乏，尚没有适用于医疗器植涂层抗凝性的体外检测标准及监管措施，企业多是采用动物实验或临床试验结果来进行评价,大大增加了企业的研发和时间成本,尤其是在深材料筛选和研发过程中无法得到快速的响应，产市不利于创新产品的快速研发和迭代.因此

5、，建立涂层抗凝血性能体外试验方法十分必要，有助于规范和监留医疗器械涂层市场的健康持续发展，最终推动整个医疗器械行业和人类健康产业的高品质发展.TCSB146-2M涂层抗凝血性能体外试验方法本文件规定了涂层抗凝血性能体外试验的总则、试验方法和报告。本文件适用于通过强结合力均匀固定在材料或器械表面的抗凝涂层.本文件不适用于能从表面快速洗脱或择放的涂层。2U猿性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其川新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部

6、分：样品制备与参照材料YYZT191!医疔器械凝血试脸方法3卜列术语和定义适用于本文件.Snticoaeu1.aitcoating通过定的初结合力均匀涂用在器械表面的具有抗凝血功能的物昉.抗腰血性能anticoagu1.atxonproperties故我向涂层具有阻止或抑制血栓形成的能力.4总则本文件推荐了用于表征涂层抗凝血性能的体外试脸方法,包括蛋白质吸附测试、血小板粘附试5金、凝血时间和体外血栓测试四种方法.5试方法5.1 白IUR1.fM试5.1.1 血当血液与医疗器械接触时，器械表面会迅速的吸附上纤维Ifi白原等血浆蛋白，吸附的血浆蛋白会进一步造成血小板的大量黏附，最终导致凝血的形成.

7、因此，评估吸冏在器械表面血浆蛋白的联附情况，可作为利断涂层抗凝性能的重要指标，5.1.2.1B三通过EUSA间接法，样M表面吸附-定址的纤维蛋白原(Fg)作为抗原，将吸附Fg的样M光与特异性的纤维蛋白原抗体结合，然后加入防标记的二抗形成发合物，城后通过底物反应产生显色信号来检测样品上吸附的Fg的含量.5.1.22样品在以pH7.4的缓冲液配置的Fg溶液中浸泡吸附1h-4h后,取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的Fg.翼于容器中依次加入纤维蛋白原抗体和带有陶标记的二抗进行结合，然后加入显色剂和终止液，测试反应液在最大吸收波长卜的吸光度值通过与无涂层的同种材料样品比较，间接反映有无涂层样品对Fg吸附成

8、的差异.注：制备体积较大或粒厚的涂层F抹耐，宜尽量减少切割面的暴露.I1.使蛋白溶液完全在盅谶样品.5.1.3方法二5.1.X1.JK理在“性环境下，策门负分子中肽键络合并将CW还原成QP3二啕琳甲酸(BCA)特异地与CU结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处的吸光度与纤维蛋白原(Fg)浓度呈畿性关系，通过建立Fg浓度一吸光度标准曲线，可计律样品表面吸附的蛋白般浓度.5.1.&2血也5.1.3.2.1将Fg用PH7.4的缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，参照BeA蛋白浓度测定试剂盒的要求加入陀置好的BCA工作液，37C孵育30min后，立即在562nm处测试吸光度值，以Fg浓衣为横坐标，吸光

9、度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程诳行拟合。5.1.3.2.2样品在Fg-PBS溶液浸泡吸附1h-4h后,取出样品轻轻洗去表面未牢固吸附的Fg.置于容器中加入BCA工作液，37七孵育30min后，立即读取反应液吸光度值,潜入标准曲线,计算得到蛋白浓度。通过与无涂层的同种材料样品比较，反映有无涂层样品对Fg吸附量的差异。注1：不同林料会有不同的觎响应值，样品应进行未吸帆的测试获取背景数据.例如PVC、像钛合金和Stt等材料采用本方法时背景值较大，在选择方法时宜结合材料特性充分考虑，注2：制备体秋放大或收19的涂层材料时，宜足量减少口旅场的暴嚣,且伊盗臼溶液完全陵前试验样品.6.1.&3结果分析

10、按式计算样状蛋白旗的吸附Ii1.Q=Iq-Gfv.-式中：Q-蛋白质吸附量,单位为Ug):C1样品吸附的蛋白浓度，单位为R/m1.：8样品背景的浓度,单位为UgM.;V一缓冲液体积，单位为m1.,5.1.4方法三通过痕量标记蛋白的示踪技术来定量分析蛋白在基材表面上的准确吸附量.通过氯化腆(ICI)将1251阴离子氧化成为1：512单侦，然后取代朱白肝酪第酸戒基茶环上羟基邻位的双，从而将1251标记于蛋白质。通过测域吸附在样品表面的放射量来表征货白的吸附鬓.5.1.4.2试制I将”标记后的蛋臼质溶液通过阴离子交换树淅柱以除去未反应的1251JR测定2工标记的蛋臼质溶液在280nm处的吸光值，除以

11、吸光系数后得到标记蛋白溶液的浓度.将标记蛋白溶液按比例与未标记策白溶液混合，作为1251蛋H质吸附液.将特测样品浸入1251蛋臼瓶吸附液中一定时间后，润洗并晾干，使用Y-计数器测定待测样品表面的放射仪.同时测定己知蛋白质含用的,：51蛋白质吸网液的放射状，从而定址我征样从发面蛋白质的吸附.5.2 AzMfittWMIft5.2.1 虺在凝血形成过程中,肌小板的拈阳和聚集扮演重要的角色.粘附在器械表面的血小板活化后会科放大疑促凝物质，并发生形态的变化，加I速血小板的聚集和活化,从而使凝血反应急剧犷大,因此评估器械表面黏附血小板的形态和数届.可作为判断涂层抗凝性能的重要指标.5.2.2 试例I样品

12、或对照材料与新鲜的抗凝全曲或南面小板血浓(PRP)37C下接触孵育后用生理盐水轻轻洗去表面非黏附的血小板，宜采取包括但.不限于以下方法时样品表面黏附的血小板进行观察和分析：a)样品经乙醉悌度脱水、戊二酹固定、嘤金后采用扫描电子显微就(SEM)观察样品表面血小板的数量、分布和形态：b)样品钱固定、免校组化杂色、晾干后采用荧光显做镜观察样品农面血小板数收和分布：O来用细胞裂蝌液肉样品表面黏附的血小板进行裂解，参照市用乳酸脱氮情(1.DH)活性浓度试剂盒的测试方法检测裂斛液中U)H活性浓度，在样品之间间接比较血小板豺附的数依，注1:与样品养育后的全血或IRp也可进行血，J频计敢，比较样品接触前后的1

13、1小板的变化。注2：宜使用他阑扒S御MO行试验，若例4以硼5血液,应融E其适宜性.汨:宜优先知出而阳线相似件圆态条件进行网.例妞nd1.er1.aP御模型.5.3 蕤血时间5.3.1 假述本方法适用于带肝索涂层的医疗潺械.肝素通过对抗凝血构的激活阻断凝血反应,导致凝血时间延长.因此,比较样品接触血液后凝血时间的变化，可以反映样品的抗凝效果.5.3.2 试Ift例I按YY/T1911方法制备血浆、兔脑磷脂和氯化钙溶液,按GB/T16886.12的规定制备样品.试脸样品和血浆宜接接触，依次加入预热的免陋磷脂和纨化钙溶液后，样品不取出，肉眼观察血聚中出现的冰状凝固物的时间(最长至5in),用计时器以

14、秒为单位记录。注：也可的H(i1.仪获得凝由对1访新蟠果.5.4 体外H检皿医疗器帔和全血直接接触后会吸附或钻附各类血浆蛋白和血细胞等，激活凝血途径，最终形成血栓.评估器械和全血接触后表面血栓的形成情况，可以反映样品的抗凝效果.5.4.2iC*M样处或对照材料与新鲜的全血37P下接触物仔后用生埋盐水轻轻涮洗，然后肉眼或显微镜观察器械衣面形成的血栓情况.也可称fit生成If1.1.栓的湿重或干重等指标.注I：宜使用期厥人新鲜Ik液进行阚,若使用其他硼血液，应验证其适雌全血可使用：m陆凝人体全血、人体全血、抗凝人体复期除血等，注2：宣优煤用与临床场景相蚁的动态条件进行试盼例MmJ1.0制模型，财育

15、时长的选择根据样品临闲到途稀麒目的晚.6报告试验报告应包括但不限于以下内容：a）样品的识别；b）样品制备方法；O测试方法；d）测试条件：e）测试结果。IHI46224I1.JGBT14233.2医用愉液、输血、注射洪具检验方法第2部分：生物学试验方法2GB.T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液楣互作用试验选择31YY1631.2输血器与血液成分相容性测定第2部分：曲液成分损伤评定4YY1649.1医疗器械与血小板相互作用试验第1部分：体外血小板计数法5Tm1.H.Bhoga1.PeMarcusP.ea1.Hyd11)phi1.icS1.CoatingInhibitsP1.ate1.etAdhesiononStemSUrfaCeSInitia1.Resu1.tsInVitrO“.Cardiovascu1.ar&Interventiona1.Radio1.ogy,2018:1.-7,1.)01.:10.1.007s00270-018-2036-7.