发热伴血小板减少综合征血清学、病原学诊断方法、病原学、临床及流行病学资料.docx

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1、附录A（规范性）发热伴血小板减少综合征血清特异性抗体桧测A.1IgM捕获EiJSA法（MacE1.ISA）检测SFTS病雨IgM抗体A.1.1原理根据抗原抗体特异性结合的原理，用醉标板中预包被的抗人IKV抗体（抗UtS）捕获待检测血清中的IrM抗体,加入侪标病毒抗原.或先后加入病毒抗原与解标特异性抗体.反应后加底物显色.显色程度与特异性IgM抗体含做呈正相关.A.1.2实验材料可根据所用试剂盒的相关要求进行调整.a）洗板机、处标仪、恒温温箱或水浴笛（37C2C.b）IO1.2001.可网移液器、10m1.吸管.C）稀作血清用的试管，d）蒸馋水或去离子水，e）吸水纸.f） SFTS病毒IgM抗体

2、E1.ISA检测试剂盒.A.1.3检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行检测.主要步骤如下.a）在包披板中加入样品稀粮液,100U1./孔,然后在相应孔中加入阴、阳性对照以及待检血清各101.b）封板膜时板后混匀，37X?姆H30min.C）用洗涤液冲洗6次，拍十。（1）每孔加入辣根过氧化物脚标记的病毒抗原，或先后加入病毒抗原与薜标特异性抗体100M1.然后重更步骤1和c）.e）于各反应孔内加显色液，混匀后置37t避光显色15min.f）加终止液（主要成分为1111.1.硫酸溶液）于好反应孔，50M1./孔，轻拍泥匀。g） 30汨内于45。仁波长处（建议用双波长450nm63Qn检测）读取每孔的

3、吸光度。A.1.4结果判Si在阴、阳性对照成立的情况下，待检血清OD假小临界伯者为阳性，小于临界伤者为阴性。临界值计算公式：够界值=阴性对照平均OD假（阴性对照OD值若小于005,则按005计算+Q.10。A.1.5意义IBM抗体阳性，衣示世者新近或曾经想染SFrS病毒，可用于临床诊断参考.A.2胶体金等标记法快速检测SFTS病毒1.gM1.gG抗体A.2.1原理在用硝酸纤维素度制备的免及层析试纸条上包被抗入IgY单克隆抗体、抗人IgGR克隆抗体，可插狭人血清中IgM和IgG抗体，采用SFTS病毒抗原作为标记抗原，若样本中含病毒特异性的IgM、IgG抗体，则检测区相应位置出现条带，A.2.2试

4、验材料可根据所用试剂;的相关要求进行调整.a）肢体金标记试纸条快速IgY/IgG检测试剂盒；b）滴管或加样器.A.2.3检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行检测，主要步骤如下,a）挺开铝箱袋，取出试剂卡，平建于水平桌面上做好标记，b）将血清标本用镀择液稀择（1:10Cn后,取适量（60u1.80U1.）滴加于测试卡上的样品孔内,c）5mn20min内观察结果.A.2.4结果判断在质控区出现紫色条带显示检测成立,拉测区出现融色条带衣示SFTS病毒特异性IKM和/或IKG抗体阳性.A,2.5意义IKwJt体阳性,衣示患者新近或曾经感染SFTS荻毒，可用于临床诊断参考.IgG抗体阳性,提示患者曾受到

5、SFrS病毒感央；恢复期较急性期IgG抗体阳转，可确诊，A.3间接酶联免疫吸附试脸脸测抗SFTS病毒IgC抗体A.3.1原理招SFrS病毒抗原包被他标板,结合样本中病毒特异性抗体,再加他标记的抗人IgG抗体进行检测.反应后加底物显色或发光，显色程质或发光强度与特异性IgG抗体含量呈正相关.A.3.2试验材料可根据所用试剂盒的相关要求进行调整。a）洗板机、的标仪、恒温湿箱或水浴箱（37C2,Cb）IC1.U1.20OU1.可周移液器、10m1.吸管。C）稀择血清用的试管.d）蒸端水或去离子水.e）吸水纸.f） SFTS桥毒IgGtt体E1.1.SA检测试剂自。A.3.3检测步磔应参考所选用试剂盒

6、说明书进行检测，主要步骤如下,a）在包被板中加入样品稀择液，100n1.孔，然后在相应孔中加入阴、阳性对照以及不同稀林度的恃检血清.b）封板膜封板后混匀.37T娣育40三in.c）用洗涤液冲洗6次，拍干.d）每孔加入辣根过氧化物防标记的再结合物1001.,然后曳复步骤h）和c）.e）于各反应孔内加显色液，混匀后就37C避光显色15min.f）加终止液（主要成分为1n1.1.磷酸溶液）于年反应孔，50u1./孔，轻拍混匀.g） 30min内干450nm波长处读取每孔的吸光度.A.3.4结果判断在阴、阳性而照成立的情况卜，待检血清OD值M临界值者为阳性，小于临界值者为阴性,临界值计算公式：临界优-

7、阴性对照平均OMfi（阴性对照0值若小于0.05.则按0.05计算）+0.10.A.3.5意义阳性结果,提示曾受SFTS病毒感染.恢发期血清抗体滴度比急性期抗体阳转或滴度有，1倍或以上升高.可确诊“A.4间接免疫焚光法（IFA）榜测SFTS病SjIgG抗体A.4.1原理利用抗原抗体反应具有高度的特异性的特点，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与其相应的抗原结合后，在荧光显微境卜早.现一种特异性荧光反应.根据荧光整做钺卜是否存在特异性荧光进行结果判定.A. 4.2试验材料材料与试剂如卜，可根据所用试剂盒的相关要求进行调整。a）抗原片：SFTS精毒标准毋株感染VCrUE6制备，低温干燥保

8、存。b） R1.阴性对照：患者恢一期血清（阳性对照）、阴性血清.c）英光素标记羊抗人（或像抗人Igc抗体.d）常用稀林液：IXPBS,伊文思世等。e）荧光显澈镜。A. 4.3检测步彝应参考所选用试剂盒说明书进行检测，主要步骤如下,a）用IXPBS稀择待检血清，从1:20开始做4倍连续梅铎至1:320,或至所需要的林择度.b）按照稀译度从高到低的顶序依次加入恃检血清,加入城以殂盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期如清.下排为恢复期血清）,同时设阳性、阴性对照,在37C湿余好育30min.c）用IXPBS洗涤3次，每次5min,再用蒸谣水洗涤3次脱盐，室品收干.d）用含伊文思性PBS按

9、工作浓度稀作受光结合物，斑孔加入适汆（以完全（茨细胤面为准），在37C湿怠孵育30min,然后步骤同c）.e）荧光显微段观察结果.B. 4.4结果判断细脆内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分缶在感染细胞的帼浆内.根据是否出现特异性荧光、荧光亮便、出现灵光的阳性细胞数占比定工或定性对结果进行判定,荧光反战大致分为，无特异性荧光者为“”.检测抗体滴度时,以能观察到明显特异性荧光反应的最高血清稀科度的倒数表示.C. 4.5意义阳性结果.表明曾受到SFTS病毒感染：愦复期血清抗体阳转.或抗体滴度较急性期抗体滴度有4倍或4倍以上开岛.可确诊.B1.3检测步理应参考所选用试剂盒说明书进行抽测，主要步骤如卜a）

10、病毒RNA提取：按试剂说明书操作.制符病糅RNA.b）逆转录合成CDNA：可用随机引物或病毒特弁性引物,按照逆转录试剂盒说明书进行.c） IjeR犷增：盘据所用PCR扩增试剂盒,配置反应体系.第一轮PCR反应体系的上下游引物为外套引物，模板为CDMU建议反应条件：95C3min预变性：94C30SeC变性、55*C30SeC退火、7291Inin延伸,共35个循环：72TIomin延伸。笫二轮PCR反应体系的上下游引物为内伸引物,模板为第一轮PCR产物.建议反应条件：953min预变性;94C30sec变性、52C30SCC退火、72-C45SeCSi伸,共40个循环：721CIomin延伸.

11、d） 结果判定：1.5%浓度琼脂糖电泳分析,根据犷地条带大小进行鉴定.若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明SFTS病毒核酸扩增阳性。必要时.可进行：e） PCR片段的回收和核甘酸序列测定：切下特异分子量条带,用凝胶电泳回收试剂盒回收纯化所扩增的DNA片段,测序仪测序.B. 1.4意义排除PCR污染后，扩增到特异性条带可确诊，阴性结果不能排除标班感染B.2实时荧光定量RT-PCRGIRT-PCR）法检测SFTS病而核酸8.2.1原理根据SFTS病曲蔚因现序列特征，设计特异性引物和特异性荧光标记核酸探针,可快速实现病毒检测探针结合部位位于引物结合区域内,其5端和3端可分别标记不同的荧光素.称为

12、报告荧光基团（用R表示）和淬灭荧光基团（用Q表示,淬灭荧光基团也可用小沟结合物（MGB）.当引物和探针同时与目的基因片段结合时，探针R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光佶号：当PCR扩增延伸到探针结合部位时，Taq懒发挥5-3外切核酸前的功能，将探针水解成单核甘酸，探针上的R基团游窗择放，所发出的笑光不再为Q旗团所泮灭，可被检测仪接收识别，随若PCR循环扩珀反应的延续，R和Q热团游离于溶液中的量不断增加.仪器UJ维续检测到R所发出的荧光信号。qRT-PCR可定性或定豉检测标本中的病毒核酸.8. 2.2试验材料主要试剂及仪潺设法如卜，uj根据所用试剂的相关要求进行调整.

13、a） RNA提取试剂盒.b） SFTS病毒核酸检测引物及探针（表2）,或其他SFTS病毒实时荧光RT-RCR检测试剂盒.C）移液器（10H1.,201.,100H1.200U1000D及配套吸头、PCR反应管、离心管（1.5m1.及管架、台式离速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、实时荧光PCR仪等，表2SFTS病毒实时荧光RT-PeR法核酸检测参考引物及探针序列片段引物名称ti序列(5,-3,)SS-FI101-1125GGCTCCCTCAAGCAcTTGTAAAS-R1155-1178TgccttcaccaagactatcaatgtS-Probe1127-1146TCXHSRed-TTCTGTe

14、nGCTG(;CT(XX；C(；C-B1.1.Q2MM-F13691393,GGTGGCTGTTCTC11TTGM-R1424-1445GCCTTAAGGACAnGGTGAGTAW-Probe1394-1420IAM-TCATCCTCC1C(JATATGCG(ICCC-BIIQ11.1.-F31383162AGTCTAGGTCATCTGATCCGTnAG1.-R3209-3230TGTAAG1.TCGCCCTnGTCCAT1.-Probe31683197HEXCTGCGCGCCTTCGTGGTAjTGGGB1.1.Q1.8. 2.3检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行检测，主要步骤如下.a）病

15、说Rw提取：按试剂说明书掾作，制备病毒RNA,b）实时荧光RT-PCR扩增：根据所用实时荧光RT-PCR检测试剂，配置犷墙反应体系。使用SFTS病甫特异性引物和探针进行实时荧光PeR扩埴.建议反应条件：5030min；95TIOairu9515see.60C45sec.扩增40个循环.反应条件可根据所用试剂和荧光PCR仪器进行优化调整.9. 2.4结果判断以荧光PCR反应的前315个循环的荧光信号作为本底信号,以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环间值（Ct值）,以Ctft38可判断为阴性，C1.值处于3510之间者，需采用另一套耳物探针或其他检测方法进行检测判断。10. 2.5意义排除污染后，检出病揖核酸可确诊,用于甲期诊断，阴性结果不能排除