《鹅星状病毒病诊断与防控技术规范》地方标准草案.docx

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1、ICS11.220CCS841DB51DBXX/TXXXXXXXX鹅星状病毒病诊断与防控技术规范Technica1.specificationfordiagnosisandcontro1.ofgooseastrovirusdisease（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上.XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施四川省市场监督管理局发布前才1范围12燃慈性引用文件13术语和定义14临床诊断14.1漉行病学14.2酶床症状14.3剖检病变24.4Ia床诊断结果判定25实验室诊断25.1样本采集与处理15. 2样本分子检测15.3 病焉分离鉴定15.4

2、 实验室诊断结果判定16防控措施6. 1隔离6.2消毒6.3种鹤疫苗免监6.4年鹅特异性抗体治疗37无害化处理4网录A（规范性）鹅星状嵇毒RT-PCR检测方法及结果划定5A.1引物（10三oi1.）6A. 2鹅星状病毒RT-PCR检测方法及结果判定3附录B（规范性）鹅星状病毒荧光定肽RT-PCR3B. 1引物（IoUBO1儿6B.2鹅星状病毒荧光定StPCR检测方法及结果判定6网录C规范性鹅星状病型分离4C1.材料4C. 2分离方法C.3分离结果判定4附录D（规范性）鹅星状病毒抗体间接E1.ISA4DJ材料4D.2鹅星状病毒抗体间接E1.ISA检测方法及结果判定5-1.jU-X-刖百木文件按照

3、GB/T1.1-2020E标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则3规定起隼。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解择。本文件由四川省市场监督管理局批准发布.本文件起草单位：西南民族大学本文件主要起草人：张焕容、杨发龙、张凯、陈:K.I1.1.鹅星状病毒病诊断与防控技术规范1葩围本文件规定了昭星状病毒病临床疑似病例的判断、分子诊断、栖卷分两鉴定等诊断依据,疫苗免疫、病毒抗体间接E1.1.SA检测和特异性抗体治疗、无害化处理等防控技术规范.本文件适用于魁星状病毒病的诊断、投情处理、预防与控制.2规楚性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的

4、引用文件，仅该11期对应的版本适用于本文件：不注11期的引用文件，其嫉新版本(包括所有的撼改单适用于木文件。GB19489实验室生物安全通用要求NVTM1-2016兽医诊断样本采集、傀存与运输技术规范病死及病杏动物无容化处理技术规范(农医发(2017)259)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件.3 .1鹤星状病毒病该病是由鹏星状病毒(gooseastrovims,GoAs(V)述柒馅型引发的一种病毒性传染病.该病揖主要感染251龄以内的雏鹅，病购主要表现为跋行、羽毛稀疏、全身多殂织器官广泛性尿酸盐沉积。该病为201S年以来鹅新发的疫病，4临床诊断4 1流行病学病鹅、陶性带毒鹅、带傩种蛋是主

5、要传染源,自然感染潜伏期3d,既可垂直传播,也可水平传播.各品种船均易运,最H可在3日龄发病.死亡率30%-40%,最高可达50%.5临床症状病的精神沉郁,食欲减退或废绝.饮水量增加.消瘦,翅下垂，双腹燧痪倒地,排白色稀便.漫殖腔周围稀便污染.A4剖检病变病死鹏心、肘、脾、肺、肾、用肠道等密宫表面,各关节周雨及关节腔内.甚至血管周围,均可见白色双酸盐沉积.AA临床诊断结果判定符合41流行病学特征病鹅出现4.2临床症状和4.3剖检病变.可判定为明星状萌毒病疑似病例.应进一步进行实验室诊断.5实袈室诊断实验室生物安全要求按照GB19489执行.51样本采集与处理按照NY/T541-2016小址采集

6、病鹅泄殖腔棉拭子5g10g,濒死解剖检取肝、脾、肾等实质静白5g-10g.置RNA保存液,-25C及以下保存,临床样本运输不超过48h,立即按附求A提取RNA并反转录合成cDNA.无菌操作大量采集典型病变组织器官作为病毒分温的样本-20C及以下保存.5 2样本分子检测以5的CDNA为模桢，采用附录B鹏星状病毒普通PCR或附录C荧光定量PCR方法检测.53痛击分通培养5.3 !病毒分离样本的处理取10-2Og在5.2中检测为阳性的病死鹅肝、脾、肾等组织样本并眼碎,与无菌生理盐水按1:5(WJV)比例混合并磨碎，反笑冻融三次，80rmin,4C离心15min后取上清，0.22m泄膜过泄除的后爸用。

7、5.3.2 细胞分璃病卷5.3.2.1 1.MH细胞准备吸弃细施培养液,用含1%双抗的PBS润洗3次.加入0.25%胰蛋白柄消化细胞1.2mm.吸弃消化液.加入5m1.含0.25%腴唐的DMEM/F1.2细胞培养液,轻轻吹打至25而细胞瓶壁细胞全部脱落,消化后分散的细胞在5%CO2笄箱中37C培养24h-36h.当细胞密度达到80%时，用于分离病毒.53.2.2精型分肉培养吸弃旧的培笄液,用无菌PBS洗涤细胞3次后，将5.3.1处埋好的样品Im1.接种到2511细胞械的单层细胞上，在CO2培养箱中37C感作培界Ih后弄去接种液,添加细胞维持培养液，在CO2养箱继续培养。连续培养Sd,越大观察细

8、恂状态；待细胞液变黄，-80C反复冻瞅3次，经SooOrPm离心10min.取上消.用5.2方法进行检测上清置-80P保存.5.3.3 鹅胚分成病毒5.3.3.1 鹅胚准备将非免疫鹅胚置干孵化器中37C下孵育至I1.13H龄,用干病毒分禹.5.3.3.2 的胚接种取531中病毒液0.5m1.接种鹅胚尿粪腔，同时设生理盐水接种对照胚，置广褥化器中37C下相闫.奔去24h内死亡呼胚，其余劫肚死亡后及时收获胚体和尿囊液。未死亡鹅肝观察Sd后,于4T冰箱过夜后收获胚体和尿囊液,用5.2方法进行检测.尿囊液置-SOC保存.5.4 实险室诊断结果判定.临床样本分子检测阳性,或1.MH细胞或静胚分离的精毒经

9、分子检测阳性,均利定为实脸室诊断阳性,6诊断结果判定6.1 可疑临床症状和剖检病变与4.2和4.3相符者，判定为可疑.进一步做实验室诊断”6.2 确诊临床样本分子检测阳性者,或病毒分肉时见死胚绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积,或胚体尿酸盐沉积，或割检胚体见各组织器官尿酸盐沉积,且病科接种细胞的培界物和鹅胚尿囊液样本分子检测用性，判定为确诊。6购星状病毒感染综合判定根据临床诊断和实验室诊断的判定结果，可对鹅星状病毒感染进行综合判定。6.1 若病附与4.2和4.3中所描述相符,且床样本分子检测阳性，域1.MH细胞或鹅胚分离的病外经分子检测阳性,则可判定为解星状病毒感染.6.2 若病肋与4.2和4.3中所

10、描述部分相符，但临床样本分子检测阳性，或1.MH细胤或鹅胚分解的病毒经分子检测阳性，则可判定为鹅星状病毒感染。7防控措施7.1隔离发现疑似疫情，立即隔离患病精。7.2消毒对粉鹅污奥的场所、用具、物品等沏底消毒。对附舍地面和荒尿沟梏清清后消毒，可采用35%来苏尔溶液呜雾消格,20%生石灰粉涂增和地面消毒。饲养用具料槽和水槽等510%的热碱水或3%的苛性物溶液或35%米苏尔洗涤消毒,消毒后2h6h,用清水洗净斜槽和水梢，待干燥后方可使用.运动场地消除黄使和杂草后，用5-10%的热碱水或者嫩上生石灰消毒.7.3加强饲养管理避免饲料发蠹和变质,饲料应便于消化,做到蛋白质、维生素和犷物质等的科学搭配.鹏

11、台环境卫生，确保通风良好.74种的疫苗免疫灭活疫苗于种鸭开产前每隔2周免役一次.共免役23次,用附录D的抗体检测方法检测种鹅抗体水平，确保种鹅生产期内维持高水平抗体.75雏幽特异性杭体治疗采用而免卵黄抗体对发病初期的罐醇进行特异性治疗。8无害化处理病鹅按照农业部关于“病死及病害动物无害化处理技术规范(农医发(2017)25号)”进行无害化处埋.Ptt录a（规殖性）核酸提取及反转录A. 1核酸提取a）取MWH1.样本处埋液箔于ISm1.去的EP管中，加入7001.Trizo1.剧烈混合15s,冰上静置IOmin,加入200H1.氯仿，剧烈混合15s,冰上惮田IOmin,4匕1200OrPm离心I

12、5min；b）取500P1.上清液至新管，加入5001.异内静，上下顺倒混匀10次，冰上静置IOmin,4I2（XK）rpm离心15min：C）弃上消，加入Im1.75%DEPC冰乙醇洗涤一次，4C1200OrPm离心IQmin：d）尽就吸除上清，空温干燥5-10min.用20从1.DEPC水溶解，-80。C保存.A.2反转录反转录试剂峋置成都市聋为基因生物科技有限公司.按照下衣所示体系201.）,25VIOmin,55C15min,85C5min,将RNA反转录曲DNA.试剂用盘RNA模板71.DEPC-IrcatcdWater61.5Rcac：2Taq151.上、下游引物各11.CDNA模

13、板31.ddH2OIO1.反应条件：94C预变性5min：94C变性30s、62C退火30s,72C延伸45s，35个循环：72P延伸IOmin,反应结束.B.2.2结果判定阳性对照出现329bp特异性扩增条带,而阴性对照无条带.判定跆星状病毒普通PCR检测结果有效.阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实物中同时满足,否则,本次实验无效，需重新进行.在阴阳性结果有效的前提下,待检样品出现329bp的扩地条带,即判定待检样M为鹅星状病毒阳性.若样品无条带，则为鹅星状病毒阳性.Ptt录C（规殖性）状病毒烫光定*CRfA.1引物（IOgmoh1.）GAstV-qK,R-F:5,-TGAAGCAACAG

14、ACAGAACGG-3GAMvpPCR-R:S-GGACAG：2FasSYBRGrccnqPCRMasterMixUDGIO1.,上、下游引物各0.41.,模板11.,加入JdHg补足至251.,最佳反应条件：95C变性5s、60C退火30s,共40个循环，烙解曲线：95I?15s.60C60s、9SC15s.C.2.2结果判定C. 2.2.1期值设定检测结束后，根据收集的荧光曲线和CI值宜按读取检测结果，C1.值为每个反应管的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数.阳值设定原则是根据仪济噪音情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲税的最高点为准.C2.2.2质控标准阴性对照无。值.且无典型扩增曲线：或阴性对照C（ft35.0,出现扩增曲线,但熔解曲线于HOC左右未H1.现明显的峰（ft.阳性对照C1.伯30.0,并出现典型的扩增曲戏，增解曲践于80C左右出现明显的峰伪，阴性和阳性对照成立，否则