RTPCR原理和实验步骤.docx

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1、RT-PCR原理与试验步骤一、学问背景：1、基因表达：DNA*-RNAProtein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋臼基因10个丝心蛋白mRNA(每个mRNA存活4d,可以合成TO,个丝心蛋白)共合成10个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是特别重要的。2、PCR技术(POIymeraSeChainreaCtiOn)：即聚合醐健式反应。在模板、引物和四种脱氧核件酸存在的条件下依粮于DNA聚合醐的解促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列确定。反应分三步：A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单捱DNA;B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使

2、引物与模板结合。C.延长：在DNA聚合酶和dNTPs与Mg2+存在下，退火引物沿53,方向延长。以上三步为个循环，如此反复。3、逆转求能和RT-PCR逆转术醐(reversetranscriptase)是存在干RNA病赤体内的依靠RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依靠RNA的DNA聚合醐活性：以RNA为模板合成CDNA第条链；2、RnaSe水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA;3、依能DNA的DNA聚合能活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的打算：1.引物的设计与其原则：D引物的特异性确定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个试验有

3、着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以与可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽盘选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2)引物设计原则的把握引物设计原则包括：a、引物长度:一般为1530bp,引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延K温度会超过Taq施的最适温度，也影响反应的特异性。b、弑基分布：四种减基最好应随机分布，避开喋吟或喀噪的聚集存在，特殊是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40%60%,PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去51

4、0度。c、3,端要求：3端必需与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位减基是A时错配的引发效率毋低，G、C居中间，因此引物的3端最好选用A、G、C而尽可能避开连续出现两个以上的T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复件。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应方多于4个连续碱必互补，3*端不应超过2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在今g、5,端无严格限制：5,末端碱基可以游离，但最好是G或C,使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、醐切位点等）等等。依据试验目的选

5、择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0,Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。2、耗材：试验所用的接触样拈的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭曲和灭活DEPC）03、试剂打算:变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醉、75%酒精、经DEPC处理并府压的水。三、RNA的蕤取方法RT-PCR中从细胞分别的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分别的最关键因素是尽量削减RNA酶的污染.（IRNA施活性特别稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA醐外，环境中也存在大量RNA麟C因此

6、在提取RNA时，应尽责创建一个无RNA醐的环境，包括去除外源性RNA陶污染和抑制内源性RNA施活性，主要是采纳焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA能，通过RNA怖的阻抑蛋日Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫制酸股抑制内源性RNA悔.RT-PCR步骤：1、RNA的拐取：_50-10Omg里冢加08刑变性港匀浆，约IOe个维胞加08m改性清，佛入EPiJ内反复吹H10-20次UU加0Iml乙酸钠，05ml水馆和留，02mlItfJ1充分浸匀，5分钟&无，12000g20mmU1小心杼上层无色活体转移入新EP青内，切勿取到中层白色物质（取即可U:制于明肪、隆技多的组织样品，可以再加水馋和诙加

7、氧仿再攥取一次以瑞高级度Il二耐体积导程，轻峻耸倒混匀，-20V830rnnIl4t.i2000gxWmin.可看到青民台悭上有白色五海即为RHA,算会上港.加03ml变性涌和03ml舁再6?亚新悬起五淀，-20tttfi3011ifl,4112000gX10mnn开去上清，加1E76%乙M吹H悬起沉淀，三fiWH3mm可-20七保存）4P75000X5mm,弁上漕，灭浦冷纸U加建重（203左右QEaC处理过的水，RHA（可200保存,期23幅行SO传，于核皎空白测定2、CDNA的合成：逆转录体系的组成*DEPC处理水8ulIOmMdNTPs2.5ulRandomprimers0.4ulRNa

8、sin0.5ul总RNA2.5-3ugU70C5minU速直冰水中冷却再加：5*逆转录buffer5ul逆转录酶(M-M1.)lul(200U)加水至25ulU37C60Tnin90sCSmin3、PCR.50ulPCR体系的组成I10PCRbuffer5ulMgCl23ul(2.0mM)IOmMdNTPsIulsenseprimerlul(Iumol1)antisenseprimerlu1(Iumol1)CDNA1.5ulDEPC处理水36.7ulTaqSI0.8ul(2.4U)总体积50ul4、PCR反应条件：94C5min94SCImin退火温度40SeC72C50secJl229cyc

9、les72P7min4Osec四、PCR条件的优化，PCR条件的优化王要是引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上不2C变化寻找最佳退火温度，此外Mg”浓度的调节也非吊重要.通常最隹浓度为EM左右，引物和模板的量等.五、产物的电泳和结果的测定，根据产物长度制作适宜浓度的厉.脂凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）取适量PCR产物,加上杆缓神液充分混合，点样于事先做好的琼脂钛凝胶点样孔中，IOVcm电泳45-60min.成像系统成像分析.分离不同大小DNA片段的合适块脂糕浓度凉脂铺浓度（M）线性DNA片段的有效分离花国（kb）0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-7

10、1.50.2-3六、害注竟的问题：1、汪意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人，氯仿、漠化乙淀（EB）、酚、异琉氟魅服、紫外线等2、注意避免试剂污染3、始终注意避免RNASS的污染，4、保再好自己专用的试剂,公用试剂保管好,相互协调.注慧实验室卫生RNA的琼脂糖凝胶电冰试验原理和步骤来源：生物谷访问量:3688评论(O)共享1f试瞬目的驾驭植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法C二、试期值RNA电泳可以在变性与非变性两种条件卜.进行。非变性电泳运用l0%-14%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法推断其:分广量。只有在完全变性的条件卜一，RNA的泳动率才与分子4的对数呈线性关系。因此要测定RNA

11、分f城时，肯定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制一般的1%琼脂糖凝股即可。植物RNA25SrRNA（占8085%）l8s5SIRNA及小分子RNA（占1015%）mRNA（占1-5%）333.bbiQO.C0B）寡聚脱氧胸昔(OligOdD层析柱三、试融材朴舞具与药品落菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉,紫外透射检测仪等。琼脂糖，IXTAE电泳缓冲液，05ugml漠化乙锭(EB)IOX载样缓冲液。Iah试验步磔(1)用IXTAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加IXTAE电泳线冲液至液面海盖凝胶。(2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4l于

12、封口膜上。在试验台上再加入5l1XTAE电泳缓冲液与ll的IoX栽样再冲入,混匀后，当心加入点样孔。(3)打开电源开关，调整电压至100V,使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用消水略微漂洗。在紫外透射检测仪上视察RNA电泳结果。RNA的变性琼JM谶股枪潴试剂：(1)MOPS缓冲液(10*)Q4mol1.吗琳代丙烷磺酸(MOPS)(Ph7.0),0.1mol1.NaAc,10mol1.EDTA0(2)上样染料:50%甘油，ImmoI/1.EDTA,0.4%澳酚蓝,0.4%二甲基蓝。(3)甲醛C(4)去离子甲酰胺。V电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)一

13、一水冲洗乙醇干燥3%H2O2澈满室温放置10分钟0.1%DEPC水冲洗。(1)将制胶用具用70%乙醉冲冼遍，晾干备用。(2)配制琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，置干净的100mI锥形瓶中，加入40ml蒸储水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化匀称。待胶凉至60-70C,依次向其中加入9ml甲醛、5mlIOXMOPS缓冲液和05ul溟化乙锭，混合匀称.灌制琼脂助凝胶。(3)样品打算：取DEPC处理过的500UI小离心管，依次加入如下试剂：IOxMOPS缓冲液23,甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)IOul,RNA样品4.53, 混匀。将离心管置于60C水浴中保10分钟，再置冰上2分钟,向管中加入33上样染料，混匀。(4)上样。(5)电泳：电泳槽内加入IXMoPS缓冲液，于7.5Vml的电压下电泳。(6)电泳结束后，在紫外灯F检查结果。