sd 大鼠脓毒血症.docx

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1、sd大鼠脓毒血症大鼠脓毒血症建立方法SD大鼠，体重190270g,雌雄均有,禁食24h后进行试验。用2.5%戊巴比妥钠按lmkg体重，腹腔注射麻醉大鼠，随机分为试验组和比照组（假手术组）。常规消毒腹部，在卜腹部正中心切口，长约2cm,打开腹腔找寻盲肠，当心分别其远端与大肠的系膜，盲肠内如有粪便，则把粪便当心挤向相连的大肠，试验组在盲肠远端2处用无菌4号丝线紧紧结扎，并用无菌7号针头在已结扎盲肠远段中心处贯穿穿刺。然后把盲肠推回腹腔，关闭腹腔，逐层缝合。比照组仅做开腹分别盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。术后按50ml/kg体重皮下注射生理盐水，补充手术中丢失的体液，连续视察24h,整个试验过程中

2、在室温2225X;环境进行并让大鼠自由饮水。在盲肠结扎前、结扎后8h、16h、和24h在无菌条件卜.取大鼠尾血1滴进行细胞培育，试验组还在无菌条件下取腹腔渗出液少许进行细菌培育。用结扎整个盲肠加穿刺的方法可复制出动物的志向败血症模型，因为动物模型血液细菌培育阳性，培育出来的细菌与感染灶细菌完全或部分相同，动物表现与临床败血症类似，重复性好，模型复制后有肯定的存活时间供探讨之用。有人把结扎整个盲肠改为结扎盲肠1/2,把穿刺盲肠2次改为贯穿穿刺盲肠，操作更为简便，效果也令人满足。造成盲肠缺血坏死，自身肠道的细菌进入腹腔造成感染。血液培育显示，在C1.P后16h,血液已有大肠杆菌及绿脓杆菌生成，与腹

3、腔渗出液细菌培育结果相同；培育出的菌种与报道略有不同，这可能是由于大鼠来源及试验室的条件不同造成的。试验组动物术后24h活杀，见盲肠结扎的远端已发生坏死,穿刺的针孔明显，腹腔感染，有臭味的渗出液,但腹腔未见粪便，这与人类阑尾穿刺并发腹膜炎等疾病过程相像。大鼠盲肠结扎加穿刺引起的败血症存活状况与结扎盲肠部分的多少，穿刺针孔的多少和大小有关。针孔多，针孔大，死亡率高。上述结扎整个盲肠并用9号针头刺孔2个，24hW75%大鼠死亡。右.人结扎1/2盲肠并用7号贯穿穿刺，24h无大鼠死亡。另外,饲养动物环境也是影响动物存活率的重要因素。有人曾在室温30C时，饲养C1.P大鼠5只，结果在24h内全部死亡。

4、大鼠脓毒症预后推断指标集及预料模型的初步探讨脓毒症是感染导致的全身炎症反应综合征(SIRS),是各种严峻创伤、烧伤、休克、再濯注损伤及外科大手术后常见的并发症，其死亡率高达30-50%o脓毒症的发朝气制极其困难，其困难性和小线性的特点导致了对其诊断、预料和治疗的不确定性。这也是当前脓毒症死亡率居高不下的主要缘由。因此,探讨脓毒症生物标记物,探讨脓毒症诊断、预料、疗效评估的新方法，以指导脓毒症的防治，降低其发病率和死亡率，具有重要的科学意义。本课题采纳盲肠结扎穿刺(C1.P)制备大鼠脓毒症模型，视察大鼠C1.P前后血清炎症介质TNF-,I1.T,I1.-6,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMYS

5、F),高迁移率族蛋白I(HMGBD和单核细胞趋化蛋白T(MCP-I)及血尿素刨(BUN),肌酊(Cr),乳酸脱氢酶(1.DH),谷丙转城酶(A1.T),谷草转氨髓(AST),肌酸激的(CK)和血常规的变更,探讨上述指标的变更及其与脓毒症大鼠预后的关系，试图筛选出有意义的指标建立指标集，并采纳该指标集对脓毒拉大鼠进行预后评估，以改善脓毒症大鼠预后评估的敏感性、特异性和精确度。结果如下：1 .大鼠C1.P模型复制：大鼠行C1.P后,6h起先死亡，12-24h死亡最多，72小时死亡率为59%；血清炎症介质TNF-,I1.-1,I1.-6,GM-CSF及HMGBl水平显著上升；C1.P术后12h处死大

6、鼠,发觉多个器官(心、肝、肺、脑及肾)发生组织形态学变更。2 .依据C1.P术后72h是否死亡分为存活组和死亡组。存活组大鼠C1.P术后12小时A1.T,AST,HMGBl,I1.-6以及MCP-I水平高于术前(p0.05或pO.Ol)；白细胞计数、血小板计数、CK及I1.-I水平低于术前(p0.05或p0.01)死亡组大鼠C1.P术后12小时体温、红细胞计数、红细胞比积、BUN,A1.T,AST,HMGBl,I1.6以及MCPl水平高于术前(p0.05或PO.Ol)；白细胞计数、血小板计数、血清肌酸激幅水平低于术前(p.05或p0.01)3 .死亡组C1.P术后12小时BUN,Cr,A1.T

7、,1.DH,CK,I1.-6以及MCP-I水平高于存活组(p0.05或pO.Ol)：血小板计数、血清HMGBI及GM-CSF水平低于存活组(p.05或pO.Ol).4 .C1.P术后12小时体温以及血清尿素氮、肌醉、谷丙转氨醉、肌酸激梅、I1.-6和MCP-I水平与大鼠存活结局呈负相关，而血小板计数、血清HMGBl及GM-CSF与大鼠存活结局呈正相关。5 .为推断各指标在脓毒症预后预料中的价值及选择最优的指标集,采纳1.ogistic回来对上述与脓毒症预后相关的指标进行了分析,发觉将尿素氮、肌肝、I1.-6.GM-CSF纳入方程，则预料的敏感性(86.2蛤、特异性(83.3%)以及精确度(84

8、.7%)均达最高,据此建立下述回来方程：1.ogitP=-8.367+1.124BUN+1.134Cr+0.003I1.6-0.249GM-CSF其中P为死亡与存活概率之比,1.ogitP为死亡与存活概率之比的自然对数。综上所述，本探讨在胜利复制了大鼠C1.P脓毒症模型基础上，筛选出与大鼠脓毒症预后相关的指标，并选择最优指标集建立了脓毒症预后预料模型。该预料模型显示，脓毒症大鼠血清BUN,Cr,I1.-6水平上升及GM-CSF水平降低时预后不良。上述结果为临床脓毒症的预后推断和疗效评估供应了新的或验证据和探讨思路。脓毒症模型大鼠肿瘤坏死因子和肝细胞凋亡的关系摘要：目的：探讨脓毒症大鼠肿瘤坏死因

9、子a（TNFa）与肝细胞凋亡的关系以及对肝功能的影响。方法：大鼠随机分为正常比照组和试验组，试验组采纳盲肠结扎穿孔术（C1.P）致脓毒症大鼠模型，分别于术后30、60、120、180min（C1.P术后30、60、120、180min组）处死动物，测定肝组织和血浆NFa水平，并检测肝细胞凋亡的状况，同时测定丙氨酸城基转移酶（AC1.）正常比照组相比，C1.P术后30、60、120、180min组肝细胞凋亡数、血清TNF、A1.T水平均明显上升（PO.01）,有随着时间的延长增加的趋势；与正常比照组相比，C1.P术后120、180min组血清AST含量明显上升（PO.01）；C1.P术后大鼠肝组

10、织、TNF表达强度随时间延长而有增加的趋势。结论：C1.P后大鼠肝脏产生大量TNF,与肝细胞凋亡有亲密关系，肝功能受到损伤。脓毒症是严峻创伤、感染及大手术后常见的并发症，可引起脓毒症休克及多脏器功能障碍综合征（MODS）。随着分子生物学和基因分析技术的发展和应用，人们对脓毒症发病机制的了解口益加深。肝脏是脓毒症过程中最易受损的器官之一，肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病最基本的中心环节1,肿瘤坏死因子（NF）是肝脏的一个主要炎症因子和效应分子，它与肝细胞凋亡的关系甚为亲密2我室采纳盲肠结扎穿孔术（C1.P）宜制脓毒症大鼠模型，视察TNT和肝细胞凋亡的关系以及脓毒症大鼠肝功能的变更，为临床防治脓

11、毒症供应试验依据。1材料与方法1.l试验动物及模型制备雄性WiStar大鼠30只，清洁级，体重180220g,由新疆医科高校试验动物中心供应，试验前饲养1周，禁食过夜，自由饮水。30只大鼠分为2组，试验组24只，参照文献3的方法行C1.P,建立脓毒症大鼠模型。20%乌拉坦腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中线作1.5Cm切口，结扎盲肠根部，避开结扎回肠及盲肠系膜血管，用18号针穿刺盲肠4次，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，分别于C1.P术后30、60、120和18Omin（C1.P术后30、60、120、180min组）断头取血，分别血清，并留取肝组织标本，48-72h内行石蜡包埋，切片4.5m厚，

12、脱蜡后常规HE染色。正常比照组6只，麻醉后不进行盲肠结扎穿孔，其余同（XP组。1.2视察指标和方法1.2.1肝细胞凋亡原位末端标记检测（TUNE1.）4采纳TUNE1.法进行检测肝细胞凋亡，计算5个高倍视野（400）下的凋亡细胞数，凋亡指数以每百个细胞中的凋亡数表示。1.2.2 肝组织TNF的免疫组化检测及结果判定常规石蜡切片脱蜡，3%H2O2处理IOmin消退内源性过氧化物随，PBS冲洗3min3,加枸椽酸修竟液放入微波炉（70C）8min,自然降温至室温，PBS冲洗3min3o湖盒中滴加小牛血清，室温放置25min,加入TNF抗体I室温放置2h,再滴加TNF抗体11室温放置20min后，滴

13、加抗体H1.20min后室温显色15min。PBS冲洗3min3,苏木素复染，常规封片，镜下视察。结果判定：阴性：细胞及间质内着色（一）：弱阳性：细胞内见淡黄色颗粒（）;阳性：细胞及间质内见棕黄色颗粒（+）；中等阳性：细胞及间质内见较深棕黄色颗粒（+）:强阳性：细胞及间质内见大量深棕黄色颗粒（+）。1.2.3 血清TNF、丙氨酸氨基转移酶（A1.T）、天冬氨酸城基转移酶（AST）水平的测定采纳放射免疫法测定血清TNF水平，试剂盒购FI北京东亚免疫所。采纲CX7自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测A1.T、AST水平。1.3统计学处理所得数据以S表示，计量资料采纳t检验、方差分析进行统计

14、学处理，检验水准=0.05。2结果2.1肝脏病理组织学视察正常比照组肝小叶结构完整清楚，肝细胞形态结构正常，肝窦清楚，窦内皮细胞、枯否氏细胞均未见明显变更。汇管区小叶间动静脉、小叶间胆管结构清楚，未见炎细胞。C1.P组肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝小叶结构紊乱，肝窦变窄，窦腔内有胆汁聚集，门脉区有较多炎细胞浸润。C1.P术后3h,可见肝窦间隙变宽,偶见点状坏死。2.2各组大鼠肝细胞凋亡及变更TUNE1.染色阳性细胞以肝细胞为主，很少见枯否氏细胞。C1.P术后30min时肝组织即出现细胞凋亡，随着时间的延长细胞凋亡数渐渐增加,C1.P术后30、60、120、180min组肝细胞凋亡与正常比照组相比

15、差异均有统计学意义（P0.01）（表1）。表】各组大鼠肝细胞凋亡分级及变更（略）2.3各组大鼠肝组织TNF的表达染色阳性细胞以肝细胞和枯否氏细胞为主，并间质着色，其阳性表达强度随着时间的延长而渐渐增加，正常比照组及C1.P术后30、60、120、180min组肝组织NF的表达分别为一、+、+、+、+o2.4各组大鼠血清TNF.A1.T、ST水平比较C1.P术后30minTNF即增加，但随后增加缓慢，与正常比照组相比，C1.P术后30、60、120、180Inin组血清TNF水平均明显上升（PO.OD,C1.P术后30min组与60min组相比差异无统计学意义（PO.05）,C1.P术后180m

16、in比术后120min含量明显增加（PO.01）.C1.P术后30minA1.T即增加，且呈进行性增加，C1.P术后30、60、120、180min组A1.T水平与正常比照组相比差异均有统计学意义（PO.01）,与正常比照组及C1.P术后30、60min相比,C1.P术后120、180min组AST明显上升（P0.01）（表2）。表2各组大鼠血清TNF.A1.T和AST水平比较（略）3探讨肝脏是全身最大的网状内皮系统，肝脏枯否氏细胞具有强大的中和、灭活和清除毒素的作用，其在脓毒症与器官损害的发生、发展中具有重要的调控作用。肝脏组织中单核H噬细胞是产生和释放TNF的主要细胞，也是脓毒症时最早释放且起关键作用的介