动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法.docx

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1、ICS65.020.30CCSB41T/GXAS团体标准TGXASXXXX-2024动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法DetectionofAnimaI-originChIamydiapsittacibyReaI-timePCRassay（征求意见稿）（本草案完成时间：2023.12.1）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。2024-XX-XX发布2024-XX-XX实施广西标准化协会发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由

2、广西兽医协会提出并宣贯。本文件由广西标准化协会归口。本文件起草单位：广西悦牧生物科技有限公司、桂林市动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心（广西壮族自治区屠宰技术中心）本文件主要起草人：谢守玉、黄张玲、张红云、易春华、侯慧贤、潘杰、林斌、卢春花、魏园园、谢颖、罗湘尹、班雪花、李雪珍、覃芳芸、熊毅。动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法1范围本文件规定了动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测的术语和定义、原理、试剂、仪器设备、样品采集与处理、核酸提取、核酸扩增、阴性及阳性对照、试验成立条件、结果判定等技术要求。本文件适用于动物鹦鹉热衣原体的核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容

3、通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11实时荧光PCR一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测算每次聚合醐链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。BHQBlackholequencher无荧光淬灭基团。CpsChIamydiapsittaci鹦鹉热衣原体。34CtCyclethreshold每个反应管内

4、的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数。aSFAM6-carboxyfIuorescein6-竣基荧光素。MOMPMajoroutermembraneprotein主要外膜蛋白。4原理根据CPS基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。7Man探针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。当PCR扩增时，探针被酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光报告基团发出可被仪器接收的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。5试剂51DNA提取试剂盒选用商品化的DNA提取试剂盒0K5荧光PCR扩增试剂根据不同型号的荧光PCR扩增仪，选取合适的实时荧光P

5、CR扩增试剂。54引物和探针针对CPSMOMP基因保守序列设计引物和探针，预期扩增产物大小为145bp。引物和探针序列详见附录表A.1PS4质粒提取试剂盒选用商品化的质粒提取试剂盒。6仪器设备检测需要的仪器设备见表1。表1仪器设备表序号仪器名称!生物安全柜2组织匀浆器3核酸提取仪4荧光PCR扩增仪5台式低温高速离心机（离心力12000g及以上）6微量可调移液器（量程：2.51.10J1001.2001.和100O1.等不同规格）7冰箱（28和-20及以下）7安全要求兽医实验室生物安全要求应符合GB19489的规定。8样品采集与处理R1样品采集8.1.1 家禽或鸟类拭子样品采集用无菌棉拭子采集家

6、禽或鸟类喉头、泄殖腔、眼眶分泌物，浸入Im1.50%甘油-PBS保存液中，剪去露出管外部分，盖紧离心管盖，密封后置-20C及以下保存,8.1.2 动物组织样品采集无菌采集适量死亡动物（主要包括家禽、鸟类及哺乳动物）或哺乳动物流产胎儿肺脏、扁桃体、气管和关节液等病料置于无菌容器,加冰袋冷藏,并于24h内送至实验室立即检测或置-20及以下保存。8.1.3 动物全血样品采集使用真空管（含EDTA抗凝剂）采集发病动物全血2111.5m1.,密封后冷藏或-20C及以下保存。A5样品处理8.1.4 2.1家禽或鸟类拭子样品处理家禽或鸟类的喉头、泄殖腔及眼眶拭子标记样品编号，立即进行CPS核酸检测或-20C

7、及以下储存备用。8 .2.2动物组织样品处理取适量采集的动物组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入灭菌的0.lmol/1.PBS(pH7.4)制备10%组织匀浆液。3000r/min离心处理K)Inin。取上清液，标记编号，立即进行CPS核酸检测或-20C及以下储存备用。9 .2.3动物全血样品处理动物抗凝全血标记样品编号，立即进行CPS核酸检测或-20C及以下储存备用。9核酸提取采用DNA提取试剂盒或应用自动化核酸提取仪提取各类样本中的CPS核酸。若在2h内检测可将提取的样品核酸置于冰盒上保存，否则应置于-20C及以下条件保存。10核酸扩增1扩增体系建立201.反应体系，扩增体系见表2。表2

8、荧光PCR扩增体系试剂体积PremixExTaq(ProbeqPCR)扩增酶预混液io1.CPS上游引物、下游引物(20pmol1.)各0.51.CPS探针(20PmOl1.)0.3M1.DNA模板2风灭菌双蒸水补足至201.5扩增条件95预变性5min,40个循环(95变性15s,58退火延伸30s),在每一个循环的58时收集FAM通道的荧光信号。11阴性及阳性对照111阴性对照采用灭菌双蒸水作为阴性对照。115阳性对照采用含有CPS特定基因保守序列的重组质粒p-Cps作为阳性对照。重组质粒标准品p-Cps制备方法与序列信息详见附录B。12试验成立条件阳性对照的Ct值27且出现特异性扩增曲线

9、；阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值35,表明试验成立，试验结果有效。否则，本次试验无效，需重新试验。13结果判定在试验成立条件下，当被检样品Ct值W30且出现典型的S型扩增曲线，则判为CPS核酸阳性；当被检样品无Cl值或Cl值30,则判为CPS核酸阴性。附录A（资料性）引物信息A.1CPS检测引物与探针序列见表A.1。表AJCPS检测引物与探针序列引物名称序列上游引物CPS-Fq5-Ccaagaggctataaagga-S,下游引物CPS-Rq5-CAAGCATATTCAATCTGTAAGr7小Ian探针CPS-PfamTtacctataacggctggaacaaca-Bbqi附录B（资料性）

10、阳性对照B.1P-Cps重组质粒标准品制备采用人工合成的方法合成一段含有CPSMOMP基因特定保守靶序列，该靶序列包含本文件5.3中引物和探针的核甘酸序列，将靶序列连接至PMDT8T载体中形成连接产物，将连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取重组子菌落经PCR鉴定正确，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，测算浓度，即构建成重组质粒标准品P-CPs,作为阳性对照。人工合成靶序列为：TCAAGCCCAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAACaacagaagctacagacaccaaatcagctacaattaaataccatgaatggcaagtaggcctcgccctgtcttacagattgaatatgcttGTTCCATATATTGGCGTAAACTGGTCAAGAGCAAC11TTGATGCTGATACTATCCGCATTGCTCAAC