lncRNA KCNQ1OT1和miR146a3p在子痫前期胎盘组织中的表达及调控机制的初步研究.docx

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1、目的观察长链非编码RNA(IncRNA)钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物I(Kcnqioti)和微小rna(miR)-46a-3p在子痫前期(PE)胎盘组织中的表达，并初步探索两者相互调控后对滋养细胞生物学特性的影响及作用机制,方法(1)选择2017年7月一2018年7月在省人民医院住院的PE孕妇45例为PE组，选择同期正常孕妇55例为对照组，采用实时荧光定量PCR技术检测两组胎盘组织中KCNQIOTImRNAmiR-146a-3p的表达，并分析两者的相关性。(2)采用绒毛膜滋养细胞层细胞系HTR8SVneo细胞，先分为空白对照组和脂多糖(1.PS)组，经1.PS处理24h的HTR8SV

2、neo细胞再进一步分为短发夹状RNA(sh)-KCNQ1OT1组(即沉默KCNQIoTl的表达)、miR-146a3p抑制物(inhibitor)组和Sh-KCNQlOTl+miR-146a-3pinhibitor组，共5组。应用生物信息学软件预测KCNQIOTl和miR-146a-3p的靶向关系，并采用双荧光素酶报告基因实验加以验证；分别采用活细胞计数(CCK-8)法、划痕实验、穿膜(transwell)小室实验检测HTR8SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭能力，实时荧光定量PCR技术检测细胞中KCNQIOTlmRNA、miR-146a-3p的表达,蛋白印迹(WeStemblot)法检测细胞中

3、趋化因子12(CXC1.l2)和趋化因子受体4(CXCR4)蛋白的表达。结果(I)PE组胎盘组织中KCNQIOTlmRNA的表达水平低于对照组(分别为0.230.03、0.510.04),miR-146a-3p的表达水平高于对照组(分别为0.490.03、0.310.03),两组分别比较，差异均有统计学意义(P0.05);PE组胎盘组织中KCNQIOTlmRNA的表达水平与miR-146a-3p的表达水平呈负相关(F=-0.79,P=0.031)o(2)生物信息学软件预测并经双荧光素酶报告基因实验验证显示，KCNQIOTl与(分别为0.910.03、0.350.03),miR-l46a-3p的

4、表达水平升高(分别为0.220.03、0.630.04),细胞的增殖、侵袭、迁移能力及CXC1.I2、CXCR4蛋白的表达均下降，分别比较，差异均有统计学意义(P0.05);Sh-KCNQIoTI组细胞中KCNQIOTlmRNA的表达水平(0.23+0.03)进一步下降，miR-146a-3p的表达水平(0.850.03)进一步上升，细胞的增殖、侵袭、迁移能力及CXC1.I2、CXCR4蛋白的表达均进一步下降，分别比较，差异均有统计学意义(P0.05);而miR-146a-3pinhibitor组、sh-KCNQlOTl+miR-146a-3pinhibitor组分别与Sh-KCNQIOTl组

5、比较，KCNQ1OT1mRNA的表达水平(分别为0.780.04、0.500.03)升高，miR-146aRp的表达水平(分别为0.420.03、0.460.03)下降，细胞的增殖、侵袭、迁移能力及CXC1.12,CXCR4蛋白的表达均增高，分别比较，差异均有统计学意义(P0.05)结论KCNQIOTl负调控miR-l46a-3p的表达，激活CXC1.I2/CXCR4信号通路后，可促进滋养细胞的增殖、迁移和侵袭，可能参与了PE的发病。讨论PE是妊娠期特有的多系统受累的疾病，对母儿健康造成严重的威胁，且病因不明。正常妊娠时胎盘滋养细胞的增殖和凋亡保持相对平衡状态，并维持正常的迁移、侵袭能力，而P

6、E患者存在滋养细胞凋亡活性增加、侵袭能力下降等情况，最终导致胎盘的浅着床和子宫螺旋动脉重铸失败，这也是造成不良妊娠结局的核心原因11。因此，PE属于胎盘源性疾病目前己得到较一致的认可，滋养细胞功能异常导致的胎盘功能障碍为主要病因12。最近的研究发现，InCRNA和miRNA与滋养细胞的功能密切相关。OUdejanS等13发现，IncRNASTOX2-IT3能通过调控SToX2基因的表达，导致滋养细胞迁移、侵袭能力下降及子宫螺旋动脉重塑障碍，促进PE的发生、发展。研究发现，miR-18a.miR-210和miR-455通过对多种信号通路的调节，影响胎盘滋养细胞的正常功能，参与PE的发生4-I6o

7、有研究证实，InCRNA可作为miRNA海绵，抑制miRNA的表达，进而影响靶蛋白的表达。IncRNAKCNQ10T1是一个印迹基因，只表达父源等位基因，而印迹基因的异常表达与多种疾病有关，近几年的一系列研究也逐步揭示了KCNQ10T1基因在恶性肿瘤17、炎症性疾病18和血管性疾病19等病理过程中发挥着重要作用，但对PE的影响少有报道。miR-146a-5p作为miR-146a的成员之一，参与肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的生物学过程20。miR-146a-3p与miR-146a-5p是来自同一个茎环miRNA的2个不同成熟体miR-l46a,目前，关于miR-146a-3p的作用鲜有研究。因此，本

8、研究通过组织标本和体外细胞实验探讨KCNQIOTl和miR-146a-3p与PE发生、发展之间的关系。本研究显示，PE组胎盘组织中KCNQlOTlmRNA的表达水平显著低于对照组，miR-146a-3p的表达水平显著高于对照组，进一步进行相关性分析发现，PE组胎盘组织中KCNQ10T1mRNA与miR-146a-3p的表达水平呈负相关，说明两者之间具有一定关联性；在1.PS诱导的HTR8SVneo细胞中检测到类似的结果，即1.PS组细胞中KCNQlOTlmRNA的表达水平显著低于空白对照组，miR-146a-3p的表达水平显著高于空白对照组。据此推测，KCNQIOTl和miR-146a-3p参

9、与PE的发病过程，并且KCNQIOTl可能对miR-146a-3p具有一定的调控作用。但KCNQIOTl和miR-146a-3p是如何通过影响滋养细胞功能参与PE的发病过程、机制如何以及所涉及的相关细胞通路又有哪些？本研究通过后续的体外细胞实验进一步进行验证。本研究采用1.PS刺激HTR8SVneo细胞，发现1.PS组细胞的增殖、迁移和侵袭能力均低于空白对照组，成功抑制了滋养细胞的功能，符合PE的病理生理特点。本研究中，生物信息学软件预测miR-l46a-3p为KCNQIOTl的候选靶标，双荧光素酶报告基因实验证实miR-146a-3pmimic可使WT-KCNQIOTl的荧光素酶活性降低，而

10、对两者之间结合片段突变的MUT-KCNQIoTl没有影响，说明，KCNQlOTl与miR-146a-3p之间存在靶向关系。杜晓琴21的研究显示，抑制卵巢上皮性癌细胞中KCNQlOTl的表达后，可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。有研究还发现，KCNQ10T1在乳腺癌中的表达异常，并初步证实其与下游的miR-145、周期蛋白E2(CCNE2)之间的相互调控作用关系22。提示，KCNQ1OT1参与肿瘤细胞的生物学行为，其发挥作用的机制可能与miRNA的相互作用有关，而滋养细胞与肿痛细胞相似，同样具有分化、增殖、侵袭和凋亡的生物学特性。因此，本研究采用Sh-KCNQlOTl沉默HTR8/SVneo细胞中

11、KCNQIOTI的表达后，发现miR-146a-3p的表达上调；而通过miR-146a-3pinhibitor抑制miR-146a-3p的表达后，Sh-KCNQlOTl对HTR8/SVneo细胞的抗增殖、迁移和侵袭作用均明显减弱。表明，Sh-KCNQlOTI能通过上调miR-146a-3p抑制HTR8/SVneo细胞的生物学行为，也进一步证实了IncRNAKCNQlOTl和miR-146a-3p之间的调控关系在滋养细胞中的作用。CXC1.l2是人类第10号染色体上编码基因编码的一种趋化因子蛋白，CXCR4是一种7次跨膜的G蛋白偶联受体，CXCR4通过与CXC1.12结合后形成二聚体，激活下游信

12、号分子通路，从而介导细胞黏附、迁移及运动等23。研究显示，CXC1.I2-CXCR4可介导滋养细胞生长、分化及侵袭的调控作用24。Warner等25的实验表明，CXC1.12和CXCR4在PE组胎盘组织中的表达水平低于对照组。研究还发现，CXC1.l2/CXCR4信号通路与重度PE滋养细胞的凋亡有关26。本研究发现，Sh-KCNQlOTl可降低CXC1.I2和CXCR4蛋白的表达，进一步抑制miR-146a-3p后，CXC1.I2和CXCR4蛋白的表达升高，证实了Sh-KCNQlOTI通过上调miR-146a-3p的表达可显著抑制CXC1.I2/CXCR4信号通路。综上所述，沉默KCNQIoT

13、l的表达后可上调miR-146a-3p的表达，抑制HTR8SVneo细胞的增殖、侵袭及迁移能力，阻止CXC1.l2/CXCR4信号通路的激活；抑制miR-146a-3p的表达可减弱Sh-KCNQlOTl对细胞增殖、侵袭及迁移能力的调控作用以及对CXC1.I2/CXCR4信号通路的抑制作用。KCNQ1OT1ZmiR-146a-3pCXC1.12/CXCR4作为一个调控网络分子系统可能通过影响滋养细胞的功能参与了PE的发病过程，但后续如何能找到有效的作用靶点并应用于临床，还需要进一步的探究。附子痫前期的病理生理学、挑战和展望摘要：妊娠期高血压疾病（慢性高血压、妊娠期高血压和子痫前期）具有独特的挑战

14、性,因为它们的病理改变和治疗将同时影响母亲和胎儿，有时使他们的健康状况不一致。特别是子痫前期，它是最严重的妊娠并发症之一。子痫前期通常在妊娠晚期表现为新发高血压和蛋白尿，可以迅速发展成为严重的并发症，包括孕产妇和胎儿死亡。虽然子痫前期的病因仍有争议，但临床和病理研究表明，胎盘因素是发病机制的核心。这篇综述将讨论胎盘异常和胎盘因子，如抗血管生成因子SF1.T1（可溶性FMS样酪氨酸激酶1）在子痫前期发病机制中的作用。本文将讨论血管生成生物标志物的检测，以用来进行疾病风险分层和开发制定针对血管生成通路的靶向治疗策略。最后，本文将回顾与妊娠期高血压疾病相关的母亲和儿童的长期心血管和代谢风险，特别是早

15、产型子痫前期，以及需要增加对无症状阶段干预研究的关注，目的是延缓女性心血管疾病的发生。高血压疾病是妊娠期常见的并发症，使患者及其胎儿面临远期并发症的风险，这种风险比例各不相同，还可能导致伴随一生的后遗症。妊娠期高血压根据严重程度不同分为：慢性高血压合并妊娠：妊娠前就存在的高血压（SBPNI40mmHg或DBPN90mmHg）;妊娠期高血压：妊娠20周以后诊断的高血压，不伴蛋白尿；慢性高血压并发子痫前期：慢性高血压伴有新发蛋白尿或20周后出现其他子痫前期的症状或体征，或有慢性蛋白尿伴新发高血压。子痫前期的发病率和死亡率最高，影响5%-7%的孕妇，且每年造成世界范围内7万多名孕产妇死亡和50万名胎

16、儿死亡。它是美国孕产妇死亡、危重孕产妇发生率、孕产妇入住重症监护病房、剖宫产和早产的主要原因。分娩可以使多数症状和体征得到缓解；然而，子痫前期可在分娩后持续存在，甚至在产后复发。在美国，复发或持续的产后子痫前期已成为围生期发病的一个重要危险因素。妊娠期高血压疾病，特别是早产型子痫前期，也与心血管疾病（CVD）和脑血管疾病的长期风险相关。一、子痫前期的流行病学特点及临床定义（一）子痫前期的危险因素子痫前期的危险因素已被广泛研究（表I）。主要的危险因素包括子痫前期病史、慢性高血压、孕前糖尿病、抗磷脂综征和肥胖等。其他危险因素包括孕产妇高龄、初产妇、慢性肾脏疾病病史和辅助生殖助孕。相对罕见的危险因素是子痫前期家族史和怀有13三体综合征的胎儿。子痫前期的遗传易感性己被广泛研究。2017年，一项对4380例子痫前期患者的新生儿和310238例对照新生儿的全基因组关联研究进行了分析，发现F