关于大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定.docx

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1、关于大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的-SM-actin)o结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形,放射状生长和典型的峰谷状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可

2、靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞AbstractJObjectiveToestablishtheculturemodelofrataortavascularsmoothmusclecells(VSMCs)toprovideimportantexperimentalmethodforthepathogenesisresearchofatherosclerosisinvitro.MethodsEmpIoyingtheexplantstechnique,theprimary

3、andsub-culturewerecompletedbymodifiedtissue-pieceinoculationandtrypsindigestionrespectively.Theculturedcellswereidentifiedbyphasecontrastmicroscopyandimmunohistochemicalandimmunofluorescentstaining.ResuItsAfter3daysofinoculationoftissue-pieces,VSMCsmigratedfromthevesselpieces.Theculturedcellsshowedt

4、hetypical“hillsandvalleysmorphologicalfeaturesunderthemicroscope.Immunohistochemicalandimmunofluorescentstainingwithmonoclonalantibodyagainstmouse-SM-actindemonstratedthesecellswerepositive.ConculsionltisasimpleandreliablemethodforobtaininghighlypurifiedandsatisfactoryVSMCsinshortterm,providingafavo

5、rableexperimentalplatformforresearchintothemechanismofvascularproliferousdiseasessuchasatherosclerosisandrestenosis.Keywordsrat;thoracicaorta;explantsmethod;vascularsmoothmusclecells血管平滑肌细胞(VaSCUlarsmoothmusclecells,VSMCS)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neoin

6、timaformation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关1-4o因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领域研究的热点。本研究在参考国内外文献的基础上58,结合自己的经验,采用改良的植块贴壁法成功建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型。1材料与方法1.1 动物与试剂SPF级雄性SD大鼠1只，体重(15010)g,中山大学实验动物中心提供，合格证号（粤监证字2006A064）oDMEM（Gibco）胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）、胰蛋白酶（trypsin,Sigma）T25塑料培养瓶（CoStar）、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、D

7、AB显色试剂盒（武汉博士德公司）、Frrc标记的羊抗鼠荧光二抗（SantaCruzBiochem）1.2 大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只，重约150g,颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min,同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台内。无菌条件下迅速取出全段胸主动脉，立即移入含冷PBS的无菌平皿中。使用Iml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镶去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镜反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镣穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上，并用弯镣摊平血管，再将血管转

8、移到含DMEM（10%胎牛血清）的无菌平皿中，用DMEM培养液清洗中膜层平滑肌数次后，用眼科弯剪剪切成约lmm3大小的组织块;将组织块（约15个小块/段血管）均匀贴放于25cm2培养瓶底的一处角落,间距QICm;向瓶内加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培养液，将培养瓶直立置于37团、5%CO2培养箱中6h,使组织块干涸并与瓶壁牢固贴附。6h后再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中，培养箱中静置培养3天后，细胞从组织块边缘游出后更换培养液，隔天换液1次;当细胞80%融合时，即可传代。1.3 VSMCs的传代培养当组织块周围外长的细胞相互汇合达80%融合时，即可传代：超净台内，吸弃旧培养液，将组织

9、块转入一新培养瓶加入培养基继续培养。用不含血清的DMEM培养液洗涤细胞2次，加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液2ml,室温下消化20s后转移到37团培养箱中消化Imin,镜下观察，当发现细胞回缩、间隙增大并有少数细胞脱落时，弃消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液IOmI终止消化并反复吹打瓶壁细胞成单细胞悬液，按103接种，细胞密度保持在ll06cellsml,约3天长满单层，用同法继续传代培养。1.4 台盼蓝染色鉴定传代细胞活力取消化传代的第3代VSMCs悬液9滴，加入1滴0.4%台盼蓝液(Sigma),立即混匀后吸取1滴于细胞计数板上，置光学显微镜下观察：不着色细胞为

10、活细胞。随机计数5个视野，共计数500个细胞，按成活率=不着色细胞数/500x100%计算细胞成活率。1.5 VSMCs的鉴定1.5.1 VSMCs的形态学观察组织块接种2天后，在倒置相差显微镜下连续观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等，并拍照记录。1.5.2 VSMCs的免疫组化鉴定取第3代对数生长期的细胞悬液以l106cellsml接种到预先放置盖玻片的6孔板中，置370.5%CO2培养箱中培养，待细胞长成致密单层时取出盖玻片，PBS漂洗5min3次，4%多聚甲醛室温下固定2030min,PBS再次漂洗5min3次，然后按照SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作(一

11、抗是抗鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体)。然后以苏木素复染，封固，并于相差显微镜下观察摄照。以细胞胞浆呈棕黄色为阳性细胞，计数500个细胞，计算阳性率。1.5.3 免疫荧光染色取第3代细胞进行细胞爬片，4%多聚甲醛固定IOmin,PBS洗3次，1%TritOnX-100渗透细胞膜30min,正常山羊血清370封闭60min,加一抗(-SM-actin1：200稀释,Boster)40孵育过夜，PBS洗3次,加入FITC标记的山羊抗鼠二抗(SantaCruz)370避光孵育lh,PBS洗3次，加入5gmlHoechest33342,室温孵育510min,PBS充分冲洗，甘油封片，移荧光显微镜下(Oly

12、mPus,Tokyo,JaPan)观察摄片。1.6 VSMC的生长曲线取生长状况良好的第3代细胞，常规胰酶消化传代,制成细胞密度IXIo4cellsml的单细胞悬液,接种于24孔板，500l孔,置37团、5%CO2培养箱中培养,每隔24h收集3孔，加入50lMTT(5mgml)继续培养4h,倾去液体，加入750HlDMSO溶解，振荡IOmin,转移至96孔板中，后在酶标仪上读取570nm的OD值，计算其均值。以培养时间为横轴，细胞活力(OD57Onm)为纵轴，用Sigmaplot10.0软件绘制VSMC的生长曲线。1.7 VSMCS的冻存与复苏取第2代对数生长期细胞，并于冻存前一天换液。消化细

13、胞将其收集于离心管，计数，离心弃上清，加冻存液(DMS0、血清、DMEM培养基以10603配制，现配并置于4团备用)，使细胞的最终密度为5l06ll07ml,分装入1.2ml冻存管中，置4团冰箱冷却Ih后转入-20团冰箱冷却2h,最后在-80团冰箱中过夜，次日转入液氮罐中冻存。复苏时从液氮罐中取出冻存管，直接投入37团水浴箱中，使其在Imin内融化。酒精棉球擦拭冻存管，移入超净台，用吸管吸出细胞悬液，转移入15ml离心管中，加含20%血清的培养液，离心弃上清，再次加入培养液稀释后接种于培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换培养液继续培养。2结果2.1 细胞形态学观察原代培养2天后，组织块周

14、边可见丝状物，第3天可见有少许细胞以垂直方向从组织块边缘游出(图1A),但不是所有的组织块周边都有。第6天，植块周围形成明显的细胞生长晕(图1B),细胞呈放射状排列，进而形成细胞簇;细胞形态多样，呈梭形、多角形、星形或不规则形，有的发出细胞突起;胞浆丰富，均质透明;核卵圆居中，偶见23个核仁。VSMCS彼此融合、细胞密集、平行排列，密度低时常交织呈网状，密度高时则呈漩涡状或者栅栏状,在第2周形成典型的峰，谷状生长的结构特征，不见铺路石状排列的内皮细胞，可见此法培养的VSMCs纯度很高。而且，随着萌出细胞数量的增多和细胞的增殖，细胞间相互融合，部分重叠，2周左右可逐渐铺满整个瓶底，进行首次传代。

15、A细胞动态学观察血管平滑肌细胞从组织块中游出(XlO0);B:组织块贴壁6天后形态学观察(100)A:VSMCsmigratedfromaortatissuesegment(100).B:VSMCsmorphologyafter6daysinculture(100)ffl12.2 细胞鉴定2.2.1 免疫细胞化学鉴定第3代细胞经特异的-SM-actin免疫细胞化学染色后，高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌肌动蛋白丝。核卵圆形居中，呈淡蓝色，见图2A和2Bo2.2.2 免疫荧光染色95%以上的培养细胞a-SM-actin免疫荧光染色阳性，见图2C。2.3 台盼蓝染色结

16、果计数500个细胞，其中11个为阳性，约有98%的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。2.4 VSMCs的生长曲线以培养天数(day)为横轴，细胞活力(OD57Onm)为纵轴，在半对数坐标纸上绘制VSMC的生长曲线(图3)。如图所示,VSMCs以IXlO4cellsml密度接种后第2天出现对数生长期，35天出现平台期，第6天出现衰退期。3讨论3.1 VSMCs在动脉硬化研究中的应用血管平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分，是血管中膜惟一的细胞类型，同时又是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分之一。近年来，随着分子和细胞生物学研究的深入，人们对VSMCs表型的转化(收缩型-合成型)、增殖、迁移、分化、凋亡和细胞外基质的合成与分泌等方面的认识不断深化。目前认为：VSMCS从血管中膜迁移到内膜、增殖并分泌大量的细胞外基质以及泡沫化是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄