2A肽载体.docx

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1、2A肽及其在多基因共表达中的应用摘要：2A肽(2APePtide)最初于1991年在口蹄疫病毒(FMDV)中鉴定得到，2A肽平均长度为1822氨基酸，是一种可以自裂解为小片段肽，为小RNA病毒属小核糖核酸病毒。2A肽是近年运用较多的一种构建多基因载体的工具，2A肽，与其它多基因构建策略相比，2A肽序列较短，且可以等摩尔表达，剪切效率高可达85%95%。本文就2A及类2A肽的起源、作用机制、蛋白亚定位的关系以及应用方面做一综述。关键词：2A肽；多基因载体Abstract2Apeptide(2Apeptide)wasoriginallyin1991byfootandmouthdiseaseviru

2、s(FMDV)getidentified,theaveragelengthof2Apeptide18to22aminoacids,isasmallfragmentcanbecleavedfromapeptide,asmallRNAvirus.2Apeptideisusedinrecentyearstobuildamulti-genevectortools,2Apeptides,comparedtoothermulti-geneconstruct,havetheshortersequence,andcanexpressequimolarshearhighefficiencyupto85%-95%

3、.Inthispaper,Wedoareviewontherelationshipbetweentheorigin2A,themechanismofaction,proteinlocalizationandsub-applications.Keywords：2Apeptide;Multicistronicvectors在转基因动物的构建过程中，为便利目标基因的检测，常须要以绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(Cherry)、黄色荧光蛋白(YFP)等示踪基因与目标基因同时分别表达，这就须要一个介导多个基因同时胜利表达载体构建技术。基于这一目的，一些探讨策略已得到应用：(1)双向或多启动子分别单

4、独启动多个基因表达;(2)单一启动子启动多个基因以融合蛋白形式表达；(3)多个质粒共转染及多病毒载体共感染；(4)在不同基因之间插入内部核糖体结合位点(internalribosomalentrysites,IRES);(5)在不同基因开放阅读框中间插入蛋白酶剪切位点。近来应用较多的多基因表达载体是IRES,因为IRES表达的是非偶联的蛋白，克服了融合表达活性低的缺点，并且IRES构建表达载体能进行蛋白定位的。然而，IRES含500个核昔酸，在容量有限制的载体上就限制极大，一般只能构建双基因表达载体无法实现真正意义上的多基因表达载体。同时，由于IRES作用机制使得其连接的上下游蛋白表达状况极不

5、平衡。下游蛋白表达量只有上游蛋白的10%50%。此外,IRES会对其他表达蛋白的活性产生较大影响。以上这些因素限制了IRES策略在多基因载体构建中的大量运用。2A肽属于CiS水解酶作用元件(CHYSE1s),最初在口蹄疫病毒(FMDV)中发觉，2A肽平均长度为1822氨基酸1引。2A肽可在蛋白翻译时通过核糖体跳动从自身最终2个氨基酸C末端断裂。甘氨酸和脯氨酸之间的肽链结合群在2A位点是受损的，能引发核糖体跳动而从第2个密码子起先翻译，从而使1个转录单元里2个蛋白独立表达久这种2A介导的剪切广泛存在于全部的真核动物细胞当中。因此，2A肽序列短小且前后基因表达均一的优点可胜利解决IRES功能上的局

6、限性。利用2A肽较高的剪切效率及促使上下游基因平衡表达的实力，可以改进异源多聚蛋白(如细胞表面受体、细胞因子、免疫球蛋白等)的表达效率。本文概述2A及类2A肽的起源、作用机制、蛋白亚定位的关系以及在探讨中应用。12A肽的起源2A肽于1991年在口蹄疫病毒(FMDV)中发觉，是一种可以自裂解为小片段肽，属于小RNA病毒，平均长度为1822氨基酸。在FMDV中，它可以通过核糖体跳动将自己的C-端自动裂解，同时N-端被3C/3CD蛋白酶裂解。再后来的探讨中发觉，其他小RNA病毒属诸如心病毒、马鼻病毒属(E2A)、猪肠病毒(P2A)、微小核糖核酸病毒和某些parechoviruses中也发觉有类似的2

7、A肽序列，并且发觉这些2A肽均有裂解活性。活性类2A肽序列也分别在克氏锥和Tbrucei1.lTc非ErR逆转座子开放阅读框的N末端检测到近来在紫色海胆中也发觉了肽片段，并且具有活性。另外，2A肽出现在某些非UrR逆元件像(锥体虫)和核酸结合寡聚体区域(NoD)样N-末端、或者CaterPiller蛋白中叫因此，这种限制蛋白生物发生的序列不仅出现在病毒，而且出现在与逆元件病毒相关的基因插入序列中。2A肽和类2A肽序列在真核细胞中也存在活性，从酵母到到哺乳动物。以2A肽为基础的裂解唯一的必需条件是须要80S核糖体翻译。其它2A肽序列也己在探讨中被运用，包括马鼻炎病毒，猪圆环病毒，2A肽属于CiS

8、.水解酶作用元件(CHYSEIS)。CHYSE1.序列由两部分组成：一段AA非保守序列和一段带有保守序列-D(V/I)EXNPGP的强螺旋特性的序列。翻译过程中，核糖体会跳过CHYSE1.序列中甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，终止蛋白合成，并起先下一个蛋白的翻译合成。2常见的2A肽及类2A肽序列虽然2A肽的调整机制在大部分真核细胞中普遍存在，但在原核细胞中尚未发觉。目前,有四个2A肽序列在生物医学探讨中应用较广泛,它们分别是:FMDV2A(F2A)马鼻炎病毒A病毒2A(E2A”猪圆环病毒-12A(P2A)ThoseaasignaVirUS2A(T2A)(图1)。前三个都属于小RNA病毒，第四个属于昆

9、虫病毒。FMDV属小核糖核酸病毒，是一种单链RNA病毒ssRNA,其mRNA约由8500个核酸组成，一个单独的长开放读码框含有2332个密码子，编码一个259KD的多聚蛋白。FMDV2ARNA序列在全部口蹄疫病毒中均高度保守。FemiyExamplesAbbr.Soquee32AeaaoeSitePicofneviridaeFMDVF2AVKQT1.Mrc1.UaAGDVBSNPO*PERAVE2AQCTNYA1.1.K1.AQDVKSliPGPRVIP2AArmFS1.1.KCAaDVEENPaPtrvrdaolvT2AEGROS1.XTCaDVBEKMP图1已在生物体内胜利应用的2A肽序列

10、。这些序列功能已在体内外探讨中被胜利验证。口蹄疫病毒(FMDV)；马鼻炎A病毒(ERAV)；猪圆环病毒-I(PTV1)；Thoseaasignavirus(Tav)o加粗为各2A肽序列的保守区，箭头为裂解位点。3 2A肽的作用机制对2A肽介导的多蛋白表达在探讨早期运用无细胞翻译系统(兔红细胞裂解物，小麦胚芽提取物)分析2A肽调整的裂解反应时，发觉2A肽的裂解机制不是蛋白酶酶解作用的结果【刈。探讨表明肠病毒和鼻病毒主要的裂解活性是由一个病毒编码的约17KDa的蛋白酶(2APrO)调整，在细胞质内自己N-端裂解，然后形成多个病毒蛋白。通过不同病毒P2A拼接试验发觉，同时运用异源类2A肽序列也能有效

11、提高共翻译效率。类肽序列包含一个保守区(2A,Asp-VaVne-Gli-X-Asn-Pro-GlyNB,Pro),翻译时，该保守区中2A甘氨酸和2B肺氨酸之间发生核糖体跳动引起断裂1.现阶段普遍认同的2A肽调整的翻译模型：核糖体跳动。新生2A肽被认为与核糖体外通道相互作用，诱导翻译暂停。即外通道-DXEXNPG-的2A肽将肽与tRNAGly之间的酯连接从ProIyl-tRNA（一种空间位阻亲核因子）处移走。翻译减速，prolyl-tRNA之间不能形成肽键。新生肽与tRNAGly之间的酯键水解可能发生在核糖体内，随后释放翻译产物。当与tRNAGly共价连接时，从未检测到新合成蛋白。2A肽和类2

12、A肽序列被统称为顺式作用水解元件（CHYSE1.）,反映了其在特异位点的酯键水解实力。尽管此系统仅部分说明了无细胞翻译体系中产物不平衡的缘由，但很多细胞表达探讨表明，同样的产物不平衡在培育的细胞、植物和动物中没有发觉。PeptidyhglycyURNA酯连接水解的机制至今不太清晰。但近年来，裂解机制中的转换释放（终止）因子（eRF）l和3已被发觉。这些蛋白结合到终止密码子，负责新生肽链最终一个氨基酸和它的tRNA之间的酯键水解。当开放阅读框中存在2A肽序列时，翻译复合物在肽的C-端被阻滞。其主要过程如下1川（图2）：2A新生肽和glycyl-tRNA从A位置转位到P（步骤i&ii）。PrOIy

13、l-tRNA进入A位置（步骤iii）,但可能其在此处不能形成肽键及存在此处（步骤iv）。此时，eRFl进入A位置，水解酯键，释放新生肽（步骤iv&v）。随着酯键发生水解，新生肽被释放。eRFl离开复合物，eRF3参加这一过程（步骤v&vi）0然后，出现了两个相互对立的结果。一是翻译终止在2A的C-端；二是eRFl存在于A位置，ProIyI-tRNA重新进入A位置，并被eEF2转位到P位置，下一个氨酰进入A位置合成下游序列。（步骤Vi到Viii）核糖体在2A肽C-端跳过glycyl-prolyl肽键的合成，导致2A肽与其紧连的下游蛋白的断裂U1.图22A肽在多蛋白中裂解机制4 2A肽介导的蛋白的

14、亚细胞定位2A肽介导的表达策略的优点是通过运用共翻译和翻译后信号序列，2A肽多蛋白的单个顺反子可以通过信号肽序列靶定到很多不同的亚细胞位点。1.orens及其同时通过P2A连接的N-端带有豆蔻酰化位点的GFP,含有核定位信号(N1.S)P21(一种细胞循环抑制剂)，两者分别胜利地在细胞膜和细胞核中表达。当该载体应用于T细胞系时，可以有效阻碍细胞循环“文有探讨发觉当2A肽的上游蛋白带有N端信号序列，下游蛋白没有携带任何信号序列，这两个蛋白将会被转位到ER。原当发生转位到时，反应(融合蛋白的形成)被一些上游蛋白的末端区抑制，引起“slipstreaming”作用发生。Yan及其同事探讨证明Slip

15、streaming,转位不发生在哺乳动物细胞中，即2A肽的下游蛋白须要一个分泌或膜锚定信号序列U叫5 2A肽的作用效率口蹄疫病毒(FMDV)中FMDV基因表达产物中不存在未剪切的多聚蛋白前体，因此F2A肽的自然剪切效率最高可达到100%1川。但是多数状况下，F2A人工重组蛋白的裂解和翻译后进程并不经常如愿所至。多基因载体中剪切效率与顺反子的排列依次、2A肽两端连接的核酸序列、四周氨基酸序列或蛋白质空间结构域的影响有关。另外，2A肽的剪切活性还可能与前体蛋白总量或体外细胞系有关。虽然2A肽的裂解效率在不同细胞和组织中不同，但总的来说，在细胞中的裂解效率高于机体组织中的裂解效率。由2A肽连接重链和

16、轻链的抗体在小鼠中稳定表达，不但两条链正确聚合，并且转染细胞中未检测到任何多余的抗体链，比IRES连接产生的抗体表达水平高16倍I。探讨表明，在细胞试验中T2A肽裂解活性最高，大于99%,高于E2A,P2A和F2A。探讨发觉F2A和T2A裂解效率较高于E2A,接近100%。而在人细胞系、斑马鱼和小鼠中，P2A裂解效率最高。F2A对体外构建的多顺反子载体也无法完全剪切，剪切效率大多在85%95%。2A肽裂解效率当前也存在着问题，一方面，2A肽前后被翻译的多蛋白裂解效率不同，前者相对较高，这与IRES等表现相像；另一方面，由于2A肽残基大部分融合到翻译蛋白的C-端，有可能会干扰上游蛋白的功能。裂解效率不高会导致大量未裂解蛋白积累，形成毒性蛋白，积聚在转基因表达的细胞中。提出提高裂