基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展2024.docx

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1、基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展2024摘要液相色谱-串联质谱技术具有高特异性、高通量的特点，因此在临床检验领域有快速的应用和发展，其在治疗药物监测中的应用可有效提升定量准确性与灵敏度，为患者制定个性化的最佳给药方案。但该技术目前仍面临一些挑战，自动化、质量控制、量值溯源等将是今后的发展方向。自20世纪90年代始，临床医学检验需求与技术快速发展，液相色谱-串联质谱(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)技术在治疗药物监测(therapeuticdrugmonitoringJDM)领域的应用愈加广泛。常用的T

2、DM方法分为光谱法、色谱法和免疫分析法。光谱法检测成本低,但所需样本量大，且易受代谢物或结构相似化合物干扰。色谱法适用范围广、定量准确度和精密度高，主要分为气相色谱法和液相色谱法。气相色谱法与气质联用法用于测定在一定温度下可气化且不分解的物质，因此应用范围受限。高效液相色谱法的样品前处理步骤耗较长，超高效液相色谱法所需进样体积及溶剂消耗小，但前处理流程更为复杂。免疫法基于抗原抗体的特异性结合进行检测，其中酶放大免疫法和荧光偏振免疫分析法应用最广。该法操作流程简便、自动化程度高，多用于临床大批量样本的定量。但其测定物质单一、较高的检出限与检测成本极大程度地制约了临床中低浓度药物的定量和多药高通量

3、检测的发展。LC-MS/MS技术具有高准确度、高灵敏度的特点，可区分结构类似物，交叉反应较小，已成为TDM分析的新选择。一、LC-MS/MS技术应用于TDM的方法类别（一）液相色谱-三重四极串联质谱法液相色谱-三重四极串联质谱法，已广泛应用至各类药物的TDM中，如免疫抑制剂、抗生素、抗真菌药、抗癫痫药、抗抑郁药、抗精神病药、抗凝血药、抗癌药。该法所用仪器成本相对较低，内部的三重四极杆结构被称为定量的最佳选择。其特有的多反应监测功能，可在同一样品运行时间内监测多个化合物的离子对，有利于实现各类药物的高通量检测。（二）液相色谱-四极离子阱串联质谱法应用最多的是线性离子阱复合三重四极杆质谱，其内部的

4、第三级四极杆被线性离子阱替代。Margaryan等使用线性离子阱复合三重四极杆在3.8min的色谱运行时间内测定了人血浆、脑瘤和脑脊液样品中的LY3214996（一种细胞外调节蛋白激酶抑制剂1阿贝西利（一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂）以及阿贝西利活性代谢物M2和M20的总浓度和未结合浓度。新型国产四极杆-离子阱质谱仪使用离子阱替代三重四极后端的碰撞池和第三极四极杆，其性能参数与线性离子阱复合三重四极杆相当，但其结构更为精简，目前已用于定量人血清中的25-羟基维生素D和万古霉素。该系统除定量外同样拥有多级碎裂功能，从多级碎裂角度区分质荷比相同的二级子离子，未来可用于鉴别液相色谱无法分离的同分异构

5、体，例如筛查和鉴别体内诸多药物代谢物研究。（三）液相色谱-高分辨质谱法美国食品药品监督管理局将质荷比分辨率10000的质谱定义为高分辨质谱”（highresolutionmassspectrometry,HRMSHRMS主要包括静电场轨道阱（orbitrap）质谱仪和四极杆飞行时间（quadrupoletimeOfflight,Q-TOF）质谱仪。在TDM过程中，HRMS常以全扫描模式操作，其中定量（药物浓度）和定性（药物代谢物、降解物、生物标志物和配方材料）信息可以在一次数据采集中收集，并对样品进行回顾性分析。例如，通过在先前获得的数据中提取目标质荷比来搜索降解产物或代谢物,为临床医生提供关

6、键信息。Nguyen等使用LC-Q-TOF和LC-Q-Orbitr叩测定了血浆和血清中的Rendomab（一种新型单克隆抗体药物），样品仅需沉淀蛋白后加入胰蛋白酶消化。当药物浓度为100ng/ml时，LC-Q-TOF和LC-Q-Orbitrap获得了较好的灵敏度，因此高分辨平台在定量复杂基质中的单抗药物时具有相应优势。Schuster等开发和验证了一种同位素稀释液相色谱-高分辨质谱法，用于检测11种广泛使用的全身抗真菌药。他们认为HRMS可以替代串联质谱技术，作为小分子药物TDM的一种新方法。虽然OrbitrapHRMS成本较高，但可以快速开发方法，因为在全扫描模式下不需调谐质谱参数,且使用H

7、RMS对质荷比极其相似的分析物或代谢物进行定量，无需液相进行良好分离。综上所述，液相色谱-三重四极串联质谱法因其定量能力强、灵敏度高、所需仪器设备价格相对较低的特点而广泛应用于临床实验室的定量工作中。但当液相色谱无法分离定量离子对相同的同分异构体时，其就失去了相应的优势。液相色谱-四极离子阱串联质谱法除定量之外还可实现多级碎裂，用于鉴别药物中的同分异构体，即使产物离子质荷比相同，也可通过指纹图谱中的各产物离子丰度比来区分化合物。但离子阱具有的空间电荷效应导致质荷比较小的离子碎片难以被观测到，因此可扫描的质量动态范围不高。液相色谱-高分辨质谱法可用于药物代谢研究，该法可获得化合物的准确相对分子质

8、量，有助于推断其在体内进行了何种代谢反应，探明代谢通路，若质谱仪质量准确度小于5ppm时还可推出该化合物的分子式，但HRMS较高的价格相对限制了它的广泛应用。二、LC-MS/MS技术应用于TDM的各类药物由于部分药物治疗窗窄，患者间存在个体差异，且药物暴露量受多种因素影响，因此需要对患者进行TDM,以达到提高药物疗效，减少或避免产生毒副作用的目的。(一)免疫抑制剂由于临床用药策略向最小治疗浓度方向发展,免疫抑制剂是将LC-MS/MS作为TDM分析工具后，在临床实验室中被监测的第一类药物。临床中也常使用化学发光微粒子免疫法和酶放大免疫测定法进行测定。体内产生的活性代谢物与药物自身结构类似，导致免

9、疫法易发生非特异性交叉反应，使定量结果普遍偏高。他克莫司(tacrolimuszFK506环抱菌素A(CiclosporinA,CsA西罗莫司(Sirolimus,SRL)、霉酚酸(mycophenolicacid,MPA)类衍生物是器官移植手术后最常使用的免疫抑制剂。CsA与FK506均为钙调磷酸酶抑制剂，其中FK506与FKBP12形成复合物，可抑制钙依赖性和非钙依赖性的白细胞介素-2及其他细胞因子所传递的细胞信号，抑制T细胞内蛋白质的合成。SRL作用机制与FK506类似，其形成的蛋白复合物可抑制钙依赖性和非钙依赖性的各类细胞因子所传递的细胞信号与增殖信号，抑制T细胞由G1期向向S期生长。

10、MPA是吗替麦考酚酯和麦考酚钠肠溶片的主要活性成分，是一种抗细胞增殖抑制剂。MPA通过抑制次黄瞟岭核昔酸脱氢酶而限制鸟瞟岭核甘酸的合成,进而阻断DNA的合成。FK506、CsA.SRL均可与红细胞结合，其与红细胞和在血浆中分布的比例为30：1,因此在通常情况下，需要采集静脉全血进行分析。由于全血基质复杂，因此常采用同位素稀释质谱法进行定量。干血斑采样量少，较血液样本更易储存，且成本更低，因此其应用越来越广泛。Gong等建立了一种全血中4种免疫抑制剂的高通量LC-MS/MS检测方法，样品采用一步沉淀蛋白法处理,7min内即可有效洗脱4种化合物。Koster等测定了干血斑中的免疫抑制剂，并对FK5

11、06和CsA的干血斑和全血样本均进行测定，表明这2种基质的定量结果并无差异，干血斑更适用于家庭采样后送检。(二)抗菌药物在以往的TDM策略中，其首要目的是为了预防药物产生的毒性反应。对于抗生素类药物来说，其最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)是药效学指标中的核心。该类药物的疗效同时受病原体的MIC及药物在患者体内暴露浓度的影响。对于时间依赖性抗生素,如-内酰胺类、青霉素类和碳青霉烯类抗生素，其游离药物浓度超过MIC的时间是最重要的药代动力学/药效学指数。因此，其给药的间隔时间和频率都极为重要，维持恒定的游离药物浓度是最佳的治疗策略。对于浓度依赖性

12、抗生素，如氨基糖苗类，通过其最大血药浓度与MIC的比值衡量其药效，防止耐药。目前，TDM应用最广泛的抗生素为氨基糖苗类和糖肽类。氨基糖苗类抗生素如阿米卡星、庆大霉素等，其治疗窗狭窄，易产生耳肾毒性，因此医生治疗时常选择较低给药剂量，导致体内暴露浓度过低而难以产生治疗效果。糖肽类抗生素以万古霉素为代表，该药对肾脏有明显毒性，当与耳肾毒性药物（如氨基糖苗类）合用，或肾功能减退者用药时，以及长期用药时进行TDM十分有必要。Barco等仅需50l血浆即可分析14种抗生素和一种B-内酰胺酶抑制剂。阿米卡星、万古霉素清除率与肌酊清除率高度相关，2种药物的血浆浓度以及肌醉浓度还可为建立群体药动学模型提供数据

13、支持。三嗖类药物抗真菌药主要包括伏立康嗖、泊沙康嗖、伊曲康嗖,该类药物在大剂量给药时可能导致药物蓄积而引起毒副作用。伏立康嘤由于基因多态性，可在患者体内产生快代谢或慢代谢，体内暴露浓度差异较大。肝功能损伤的患者需调整伊曲康嘤给药剂量后进行TDMoPrommas等测定了血浆中伏立康嘤的含量,并用于肝肾损害或CYP2C19代谢酶功能降低患者的TDM,同时采样量小的微透析法还可提高婴儿群体接受监测的依从性。()抗癫痫药物癫痫作为一种常见的精神系统疾病，因其具有高频复发的特点因而需要患者长期服药。第一代抗癫痫药(antiepilepticdrug,AED)苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸的治疗范围狭窄，易出

14、现药物不良反应。这三种药物与血清白蛋白结合率较高，因此增加给药剂量极易导致游离浓度翻倍，产生毒性反应,故需要密切监测血药浓度。新一代药物拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、托毗酯、加巴喷汀均具有较小的副作用。由于抗癫痫药在临床中常多药联用，因此使用LC-MS/MS同时定量多个化合物为最佳选择。Davis等使用LC-MS/MS法同时定量人血清中的14种AED,又通过液相色谱-漂移管离子迁移质谱法测定精确的质量和碰撞截面值，区分了AED各种异构体和结构相似的代谢产物，提高了定性检测的可信度。其中液相色谱-漂移管离子迁移质谱法还可识别临床中未报告的AEDoLiu等开发并验证了一种采用极性切换和定时选择反

15、应监测的LC-MS/MS方法f同时对人体血浆中的8种抗癫痫药和1种活性药物代谢物进行定量，适用于服用一种或多种AED的患者群体的TDMo(四)抗抑郁药物根据中国精神科治疗药物监测临床应用专家共识(2022年版),5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀、三环、四环类抗抑郁药阿米替林与去甲替林被列为强烈推荐进行TDM的药物。建议对抗抑郁药的母体和代谢物进行同时监测，因为二者都对治疗效果和毒性作用均有贡献，它们之间的比例也可说明药物暴露的时间以及是否发生了治疗性或过度摄入。Degreef等建立了一种高效的LC-MS/MS方法,用于同时测定血浆中的40种抗抑郁药总色谱运行时间12min,监测每个化合物的三个离

16、子对，校准曲线范围包括亚治疗浓度到毒性浓度，且建立的方法根据欧洲药品管理局的生物分析方法验证指南和补充建议得到了充分验证，其目的是为了表明所建立的LC-MS/MS方法与前处理方法具有较高的准确性与可靠性。Shin等定量了用口腔液体收集装置采集唾液样本中的18种抗抑郁药，使用联苯柱在5min内即可分离待测物，适用于在临床实验室中快速定量。（五）抗精神病药物非典型抗精神病药如奥氮平、氯氮平被强烈推荐TDM,其最主要的原因是患者服药依从性差。为防止患者假服药、藏药或过量使用药物，TDM是最有效、能保证其正常生活状态的监测手段。新型抗精神病药物的血药浓度个体差异极大，这可能与不同患者体内药物代谢酶P450的基因多态性有关。多种药物（如氯氮平、奥氮平和利培酮）是CYP2C19.CYP1A2和CYP2D6的底物，当多药联用时，药物之间的相互作用会使患者血药浓度发生较大的波动。有些抗精神病药的长效制剂，如利培酮和阿立哌嗖在肌注之后吸收缓慢，其平均表观吸收