核酸提取常见试剂的作用原理.docx

《核酸提取常见试剂的作用原理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸提取常见试剂的作用原理.docx（6页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、异硫鼠酸胭强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸别离。脏盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫鼠酸服，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在复原剂存在的情况下，异硫氟酸脏可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。盐酸服、尿素盐酸服是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胭、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂

2、复合物，当复合物被除去，从而引起NT）反响平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胭、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸脏、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胭、尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性疏基试剂1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反响过程中维持体系的复原环境。DTT,DDTE.疏基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的复原剂，同时氯化

3、后能被谷胱甘肽复原酶原位释放。DNA提取中，常使用疏基乙醇，维持缓冲液的复原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。臻基乙醉B-疏基乙醇的主要作用是破坏RNaSe蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。1复原蛋白质二硫键，使Rna酶变性2抑制酚类氧化，假设氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物紫酸等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3保护蛋白质的疏基蛋白质提取中需要臻基乙醇复原二硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胭能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上复原剂臻基乙醇或DT

4、T,能复原二硫键，使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比疏基乙静低很多。而且DTT比磕基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着PH值的降低，DTT的有效复原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。抑制Rnase活性TCEP三（2-甲酰乙基）麟盐酸盐半胱氨酸Trizol苯酚、异硫鼠酸胭、8羟基瞳咻、B-臻基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有

5、效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还参加了8羟基唾咻、异硫银酸胭、-疏基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基噗咻可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫鼠酸胭属于解偶剂，是类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸别离。B-疏基乙醇的主要作用是破坏RNaSe蛋白质中的二硫键。液氮组织破碎，裂解细胞SDS十二烷基硫酸钠阴离子去垢剂，高温(55-65C)裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸，提高盐(KAC或NaAC)浓度并降低温度(冰浴)，使S

6、DS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作简单，温和，可提取到高分子量的DNA,但产物多糖类杂质较多阳离子强外表活性剂，通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA别离溶解膜类蛋白SDS能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。(I)SDS是一种阴离子外表活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键翻开，并结合到蛋白质的疏水部位;(2)SDS可引起蛋白质构象改变(3)SD

7、S是种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性(4)形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电质粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢参加5N的NaCL你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你参加的不是NaCl而是KCL你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液Hl参加后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道S

8、DS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大局部蛋白质沉淀了，让人快乐的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。基因组DNA一旦发生断裂，只要是5010Okb大小的片断，就没有方法再被PDS共沉淀了CTABCTAB：十六烷基三甲基滨乙胺，低温时易沉淀阳离子去污剂一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的外表活性剂是一-种阳离子去污剂，低离子强度(0.1-0.5MNaCH,沉淀核酸与酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中(07mol/LNaCI),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只

9、是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后参加乙醉沉淀即可使核酸别离出来。CTAB可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA,这种去污剂参加调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中(0.7MNaCI),经过连续的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合体，异丙静/无水乙静沉淀上清即可将DNA别离出来CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用CTAB法的主要特点是用用较广CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出，因此在将其参加冰冷的植物材料时，必须预热，且离心温度不低于15度EDTA酶抑制剂，螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶螯合Mg2

10、+或Mn2+离子，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNAEDTA是去垢剂，结合离子用，而它结合的局部离子是能够诱发或者促进RNA酶活性的，比方Ca2+oEDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性碱性条件下才能够溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液调节pH。0.01M,DNaSe酶根本失活。BSA酶抑制剂，使一些降解酶的活性的外表变性精胺或其他多胺酶抑制剂，降低核酸酶的影响氟化物酶抑制剂，降低重金属氧化酶的影响PVP减少酚类、醒类、单宁类物质的影响

11、，抗氧化作用，络合多酚和稻类物质，防止多酚类褐变而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR强抑制剂，必须去除样品液氮研磨及提取缓冲液中参加PVP或PvPP等能络合多酚和砧类物质，离心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醍类，防止溶液变褐色而具有抗氧化能力提取液中参加适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度，用量根据杂质而定(1-6%),PVP同时能去除多糖，因此将PVP和臻基乙醇配合使用并调整用量，能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯I此咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。Triton-XlOOTritonXlOO之

12、类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。蛋白酶K蛋白酶K：切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的瘦基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来。蛋白酶K在较广的PH范围内均有活性(PH4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污剂：TWeen20(5%)、TritonX-100(1%)和SDS(1%)条件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局局部泌物、尿，粪便等.蛋白酶K的一般工作浓度是50100g

13、/ml蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质，灭活核酸酶(DNaSe和RNaSe),DNase和RNaSe也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代DEPC处理水的，但有些人说效果不好。蛋白酶K,威力巨大的广谱蛋白酶，95C加热10分钟，那么完全失活。数年前首次使用它替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理RNaSe-Free的水，效果也是一级棒。从此就再也不用DEPC了。配制RNA裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，参加蛋白酶K至终浓度lug/ml。轻轻混匀，室温放置15分钟后即可。枪头及离心管去除RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的

14、含lugl蛋白酶K的双蒸水，彻底浸入。室温放置30分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。RNase-Free水的获得：直接在灭菌的双蒸储水中参加蛋白酶K至终浓度lug/nd。轻轻混匀，室温放置15分钟后，灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。无蛋白质残留的RNaSe-Free水的获得：这比拟麻烦。直接在灭菌的双蒸储水中参加蛋白酶K至终浓度lugmlo轻轻混匀后，倒入专用的蒸储器中。放置15分钟后，加热蒸储，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free水。要提醒的是，该专用蒸微器头几次流出来的水，只能当普通蒸储水用，因为通道中难确保RNaSe-Free的环境；另外，一定要主

15、要密闭性，否那么，流出的水又被污染了。DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA别离，抑制细胞中DnaSe的活性，而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来！溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖饱和酚酚是种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一局部核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要参加82羟基嗟咛，以防止酚氧化。苯酚非极性分子水为极性分子使蛋白质变性，同时抑制了DNaSe的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子外表又

16、含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNaSe的降解作用。能有效使蛋白质变性而出去，酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性，从而蛋白质不会分布在水相中，防止核酸污染缺点：1.能溶解IO-15%的水，从而溶解一局部poly（八）RNAC2.不能完全抑制RNaSe的活性。酚变性大，但与水相有一定程度的互溶，大约IO-15%的水溶在酚相中，使核酸损失酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比方4M的异硫氟酸胭），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回