单胺氧化酶(MonoamineOxidaseMAO)试剂盒使用方法.docx

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1、单胺氧化酶(MonoamineOxidase,MAO)试剂盒使用方法单胺氧化酶(MonoamineOxidase,MAO)试剂盒说明书微量法100T/96S注意:正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。测定意义:MAO(EC1.4.3.4)重要存在于脊椎动物的各种器官,特别是分泌腺、脑、肝脏,在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢,含量较低,具有紧要的生理功能,其活性能反映肝纤维化的程度。另外,MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转显现紊乱,从而引发多种病症。测定原理:MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛,进一步氧化成酸;底物在36Onln处有特征汲取峰,测定36O

2、nnI光汲取下降的速率,计算MAO活性。自备试验用品及仪器:天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸储水。试剂构成和配制:提取液一:液体IoonIL义1瓶,4保管。提取液二:液体IoomLXl瓶,4。C保管。试剂一:液体12OnILXI瓶,4保管。试剂二:液体2mLXl管,4。C避光保管。粗酶液提取:1 .称取约Slg样品,加InIL预冷的提取液一充分冰浴匀浆,100Og,4,离心IOnIin,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4,离心30min,弃上清;加入InIL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷

3、的ImL试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定)。2 .细菌、真菌:依照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入InlL提取液),冰浴超声波碎裂细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后IoOO0g,4,离心IOmin,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4,离心30min,弃上清;加入LOnIL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷的LOmL试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定),取上清置于冰上待测。3.血清:直接测定Q测定操作表:1、分

4、光光度计/酶标仪预热30min,调整波长至360nm02、操作表对照管测定管酶液(L)20试剂一(L)180160试剂二(L)2020混匀,于微量石英比色皿/96孔板,对照管调零,测定36Onm处吸光值Al,然后37。C水浴60min,对照管调零,测定36Onm处吸光值A2、AA=AlA2注意:空白管只需测定一次。MAO活性计算公式:a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、按蛋白含量计算酶活定义:37,pH7.6时,每毫克蛋白质InIin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/min/mgprot)=XV反总(V样XCpr)T=114ACpr2、按样本质量计算:酶活定

5、义:37,pH7.6时,每克样品Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性(nmol/min/g鲜重)=XV反总(V样V样总XW)T=114AW3、依照细胞数量计算酶活定义:37,pH7.6时,每104个细胞Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/min/104cell)=XV反总(V样V样总X细胞数量)T=114AA细胞数量4、依照液体体积计算酶活定义:37,pH7.6时,每升血清Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/minL)=XV反总V样=114XA:底物摩尔消光系数,1460Lmol/cm;d:比色皿光

6、径,1cm;V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应中样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,gb.用96孔板测定的计算公式如下1、按蛋白含量计算酶活定义:37,pH7.6时,每毫克蛋白质Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/min/mgprot)=XV反总(V样XCpr)T=228ACpr2、按样本质量计算:酶活定义:37,pH7.6时,每克样品InIin内转化Inmc)I底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性(nmol/min/g鲜重)=XV反总(V样V样总XW)T=

7、228AW3、依照细胞数量计算酶活定义:37,pH7.6时,每104个细胞Imin内转化IninOl底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/min/104cell)=XV反总(V样V样总X细胞数量)=228AA细胞数量4、依照液体体积计算酶活定义:37,pH7.6时,每升血清Imin内转化IrImoI底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性(nmol/min/L)二XV反总V样二228000义AA:底物摩尔消光系数,1460Lmol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应总体积,0.2mL;V样:反应中样本体积,O.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g注意事项:1、吸光度变动应当掌控在0.010.8之间。否则加大样品量或稀释样品,注意计算公式中参加计算的稀释倍数要相应转变。2、样品蛋白质含量需要另外测定。

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