GB_T43160-2023正式版梨火疫病菌检疫鉴定方法.docx

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1、ICS 65.020.20CCS B 16OB中华人民共和国国家标准GB/T431602023梨火疫病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofErwiniaamylovora2024-04-01 实施2023-09-07发布国家市场监督管理总局关在国家标准化管理委员会发布本文件按照GB/TL1-2020标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、塔里木大学、三亚中国检

2、科院生物安全中心、上海海关、广州海关技术中心、乌鲁木齐海关技术中心、天津市滨海新区农业服务中心、昌吉市农业技术推广中心、伊宁海关技术中心、南京农业大学.本文件主要起草人:赵文军、田茜、张王斌、马云龙、易建平、蜘霜、王琳、张小菊、李乐书、王朝阳、孟茹、陆平、胡白石.梨火疫病菌检疫鉴定方法1范圃本文件描述了梨火疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检泅方法。本文件适用于梨、草果等蔷薇科植物植株、砧木、接穗及幼果传带的梨火疫痫襦的检疫鉴定以及病害的田间潮查与监测.2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件.3术语和定义本文件没有需饕界定的术语和定义.4梨火疫病菌后本伯息学名IErWiamyIovora

3、（Burrillt1883）Winslowetal.1920传播途径I染病的植物繁殖材料（包括种苗、砧木和接穗）、昆虫、风、雨以及被污染的包装材料和运输工具等多种自然因素及人为因索均可引起梨火疫病的传播.其中，染病的植物繁殖材料是梨火疫病远距离传播的主要途径.梨火疫病菌的其他信息参见附录A.5方法原理根据梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检浏；根据梨火疫病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检浏；根据梨火疫病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养鉴定及致病性浏定.6仪器设备和主要试剂6.1 仪器役备及用具超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压

4、灭菌锅、恒温水浴锅、小乔离心机、高速离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、BiOlog微孔板、全自动微生物鉴定仪（Biolog）、制冰机、电子天平、涡旋振荡器、微量进样器等。6.2 主要试剂2XPCR反应预混液、2X荧光PCR反应预混液等，缓冲液及培养基按附录B配制，除另有规定外,所有试剂均为分析她.7检疫鉴定方法7.1 症状检查检查植株有无梨火疫病的典型症状见附录A中的症状描述，早春为重点监测时期.主要检查嫌糖、花、果和枝干等部位，观察嫩梢是否出现焚牧羊鞭状）、变黑枯死;花和幼果是否变黑枯死;叶脉是否从叶柄基部向上变黑，枝干是否有溃疡斑以及病组织上是否有菌脓.

5、对出现典型症状或疑似症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状的檄梢、花簇、枝干、幼果等送实验室检浏饕定,对于未表现典型症状的幼微枝条,应嵬点对其顶端和基部取样。7.2 样品的制备7.2.1 显症植株样品的制备样品采集后应尽快检测，若不能及时检测，样本应在4t8匕下保存,尽可能不超过一周。采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染.样品处理应采用分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序.样品用无菌蒸储水或PH7.2的磷酸拴缓冲液（PBS）处理,直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检浏.尽量选择表现出锻典型症状并带有菌脓的植物部位（花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实）挑取病健交界部位的植物组

6、织,切成约0.1g1.0g的小块,放入装有适版PBS或无菌蒸慵水的离心管或培养皿中研磨或挤压,静置至少5min,制成样品悬浮液，用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检潮.7.2.2 无症植株样品的制备无症状样品宜单个处理,或者最多10个一组.样品处理和提取过程中小心避免交叉污染.开花期开始至果实陟大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，装入无菌袋或容器中.从待检植株上剪下长度约为20cm的嫩梢或花期时的花器.如果在冬天进行采样检询，从每株植物上采集5个10个花蕾.在实验室内，从挑选的植株上剪下花期时的花器、花筷和嫩梢下部几个叶片的叶柄基部或茎段.称取0.1g1.0g植物材料,混渍在7.2.1描述的

7、无菌蒸馈水或磷酸盐缓冲液中，制成样品悬浮液.处理由多个植物材料组成的样品时，可将其放入装有适量PBS或无菌熬慵水的无菌三角瓶中，置于摇床中室温剧烈振荡1h,制成样品悬浮液，可直接用于后续分析，也可将悬浮液转移至50mL离心管中12000r/min离心20min,弃上清液，向沉淀中加入2mL无菌蒸慵水或磷酸蚣竣冲液使其重新悬浮，制成样品富集液,用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检浏。7.3 免疫学检浏对于疑似症状样品，如新鲜的叶片、幼果等，可利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场初筛检测.采用商品化酸联免疫吸附测定（ELISA）方法进行检浏，按照说明书进行操作及结果判定.若检测结果为阴性，直接

8、判定为未检出梨火疫病菌。若检测结果为阳性,需进行分离培养鉴定及致病性测定.亦可不进行免疫学检浏，直接进行分子生物学检测.7.4 分子生物学检胸7.4.1 模板制备对于植株样品，按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明书提取样品总DNA,一20C保存备用。对于分离培养得到的疑似菌株,可直接或经裂解处理后（取适量菌悬液于L5mL离心管中，97七沸水浴IOmin,12OOOr/min离心10min,取上清液，一20C保存)作为分子生物学检冽反应模板.7.4.2 PCR凝胶电泳检浏以E.amyloora标准菌株作阳性对照，以非E.amylo

9、ora的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，同时利用靶标在梨火疫病菌质粒pEA29及染色体基因上的两对特异性扩增引物对待测样品进行PCR扩增及凝胶电泳检测,具体检测步骤按附录C执行.7.4.3 实时荧光PCR检利实时荧光PCR检测具体步骤按附录D执行,对照设置同7.4.2.7.5 分离培养鉴定按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集液后，用灭菌接种环避取悬浮液于超净工作台内在LB培养基平板上划线分离，或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释,各取100ML稀释液涂板分离，各重复3次.将培养基平板放置于恒温培养箱内，25匕恒温培养24h48h,挑取可疑单菌落进行纯化,转接2

10、次3次,随后进行致病性测定、Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定.在LB培养基上,梨火疫病菌形成乳白色菌落，菌落较大而凸起，光滑呈透镜状.而常见的污染菌草生欧文氏菌(ErWolhherbicola)在LB培养基上则形成黄色菌落。7.6 BiOlog鉴定分离物在培养后转移至BUG培养基上,30匕下培养24h,按照Biolog使用说明，调整分离物菌悬液浊度分别加入BiologGN微孔板或GEN11I微孔板中，每孔100L.微孔板30C下培养18h后用Biolog仪读数，获得测试结果.7.7 致病性测定7.7.1 幼果接种试验取梨幼果(直径约3cm5CE)洗净晾干,用灭菌刀片横切果实，置始有灭菌

11、滤纸的培养皿上(加少量无菌水).用接种针施取在LB培养基上培养24h36h的待鉴定菌落，针刺接种到幼果的果肉组织,一个横切面接种3个4个点.接种后，26T保湿培养，诱导发病和菌脓的形成。24h后，观察接种部位有无伤死和菌脓产生.实验以无菌水为对照。7.7.2 枝梢接种试验剪取梨树当年生的幼嫩枝梢，插于盛有自来水的三角瓶中，用接种针苗取在LB培养基上培养24h36h的待鉴定常落,刺伤接种到Ig端生长点下妁5cm-10Crn处；也可刺伤后，在刺伤点接种1滴(3zL5RL)浓度为I(TCFUmL的房菌悬浮液.接种后套袋254C左右保湿培养,2d3d后观察接种点是否出现变黑、组织干蜀、枝梢萎鬻等症状及

12、是否出现菌脓.8结果判定对于有典型症状的植株样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出梨火疫病菌。对于无症状样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性,初步判定为检出梨火疫病菌，若分离培养出典型菌落,Biobg鉴定为阳性或致病性测定出现典型症状，则确定检出梨火疫病菌.其中，分子生物学检浏可根据实验室条件,按照7.4.2或7.4.3进行,任意一种检测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性.致病性测定可根据实验室条件，按照7.7,1或7.7.2进行,任意一种测定方法出现典型症状则判定致病性测定结果为阳性.9样品及资料保存9.1 样品及菌种保存样品系登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨

13、火疫病菌的样品应保存于4t冰箱中，以备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后再处理.从检测样品中分离并鉴定为梨火疫病菌的菌株,应妥善保存.可采用甘油保存于超低温冰箱或冻干保存.对不需要长期保存的菌株应及时灭黄处理。9.2 结果记录与资料保存完整的实险记录应包括:样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等,并应有实验人员和审核人员的签字.现场检疫发现的可疑症状、培养基上的海荒特征和人工接种的典型症状等应及时拍照保存,酶联免疫方法应有薛联反应的原始数据，PCR凝皎电泳检测应有电泳结果照片，荧光PCR检测应布原始数据.附录A(资料性)梨火疫病菌相关资料AJ名称与分类地位中文名：梨火疫病常英文名JF

14、ireBlightofPear分类地位I细菌界(BaCteria),变形菌门(PrOteobaCteria),y-变形菌纲(GammaProteObaCteria),肠杆前目(EnterObaCteriaIeS),肠杆菌科(EnterObaCteriaCeae),欧文氏菌属(ErWini).A.2地理分布目前已报道分布的国家或地区有：a)亚洲：亚美尼亚、阿塞拜疆、中国(大陆及台湾地区)、格鲁吉亚、印度(马哈拉施特拉邦)、伊朗、以色列、日本(北海道、本州岛)、约旦、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、黎巴嫩、沙特阿拉伯、叙利亚、土耳其、越南，b)欧洲：阿尔巴尼亚、奥地利、白俄罗斯、比利时、波斯尼亚和黑塞卅

15、维那、保加利亚、克罗地亚、塞浦路斯、捷克、斯洛伐克、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国(科西嘉岛)、德国、希腑(克里特岛)、匈牙利、爱尔兰、意大利(西西里岛)、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡、北马其顿、摩尔多瓦、黑山、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、塞尔维亚、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、瑞士、乌克兰、英国(海峡群岛、北爱尔兰)；O非洲，阿尔及利亚、埃及、摩洛哥、尼日尼亚、突尼斯,d)大洋洲：澳大利亚、新西兰；e)北美洲：百慕大群岛、加拿大(艾伯塔省、不列颠哥伦比亚省、曼尼托巴、新布伦瑞克省、组芬兰省、加拿大西北地区、新斯科舍省、安大略省、爱德华王子岛、魁北克省、萨斯喀彻温省、育空地区)、旗西哥、美国(阿拉巴马州、阿肯色州、加利福尼亚州、科罗拉多州、康涅狄格州、特拉华州、佛罗里达、佐治亚州、爱达荷州、伊利诺斯州、印第安纳州、艾奥瓦州、肯塔基州、堪萨斯州、路易斯安那州、缅因州、马里兰州、马萨诸塞州、密歇根州、明尼苏达州、密西西比州、密苏里州、蒙大拿州、内布拉斯加州、新罕布什尔州、新泽西州、钮约、北卡罗来那州、北达科他州、俄亥俄州、俄克拉荷马州、俄勒冈州、宾夕法尼亚州、南卡罗来纳州、南达科他州、田纳西州、德克萨斯州、犹他州、佛蒙特州、弗吉尼亚州、华盛顿、西弗吉尼亚州、威斯康星州、怀俄明州)；D中美洲及加勒比海地区：危地马拉、海地,g)南美洲I智利、哥伦比亚、委内瑞拉.