类器官及器官芯片技术在体外胎盘模型构建中的研究进展2023.docx

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1、类器官及器官芯片技术在体外胎盘模型构建中的研究进展2023摘要胎盘具有物质交换及屏障功能，对维持胎儿生长发育至关重要。胎盘功能异常与多种不良妊娠结局有关。现有的体外胎盘模型均存在一定局限性，无法满足研究需要。目前类器官及器官芯片技术发展迅速，在药物研发、基础医学研究等方面展示出了极大的应用前景。构建自真实胎盘的类器官在细胞表型、基因表达等方面均与源组织具有高度一致性。胎盘芯片可体外模拟胎盘屏障，并在药物的胎盘通透性研究中被广泛应用。构建胎盘类器官芯片，或构建包含胎盘、子宫内膜等成分的多器官芯片，对于生殖及围产医学领域的发展具有重要意义。胎盘是哺乳动物妊娠过程中特有的器官，负责母胎之间的物质交换

2、，并具备一定的屏障功能1o胎盘结构或功能异常被证实与多种不良妊娠结局有关，例如子痫前期、胎儿宫内生长受限等2-3,其对不同药物的通透性也直接关系到胎儿的安危4。因此充分研究胎盘的结构功能对产科领域至关重要。然而，二维胞培养模型5-6、动物模型7等传统模型无法充分模拟真实胎盘，可重复性较差，成本较高，而临床试验又存在伦理争议，均无法满足当前研究需要，故亟需建立新的体外胎盘模型。近年来迅速发展的类器官及器官芯片技术为新的体外胎盘模型建立提供了思路。类器官是由干细胞或祖细胞扩增并分化形成的三维胞团，具备一定的器官功能，与传统二维培养细胞相比，在形态及功能上均更接近人体组织8-9。器官芯片以微流控技术

3、为核心，通过精确控制微升级流体，可实现体外细胞的动态培养10。该两种新型胎盘体外模型已逐步被应用于胚胎植入11-12、药物胎盘通透性4,13等研究，很大程度上克服了传统研究方法的局限性，并规避了伦理问题，在生殖及围产医学领域具有良好的应用前景。一 .胎盘的发育过程胎盘形成可追溯到受精后67d的囊胚阶段14。囊胚分为滋养外胚层(trophectoderm,TE沐口内细胞团innercellmassfICM)TE由滋养细胞构成,其中细胞滋养层细胞(cytotrophoblastzCT)是未分化细胞，在整个孕期中持续增殖并分化成所有其他的滋养细胞类型。一部分CT合胞化形成合体滋养层细胞(Syncyt

4、iotrophoblast,ST)xST是完全分化的滋养细胞，介导母胎之间的物质转运，并分泌人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)等物质1；另一部分CT分化成绒毛外滋养层细胞(extravillouscytophotroblastrEVT),侵袭蜕膜、部分子宫肌层，侵袭并重铸子宫螺旋动脉1,12。3种滋养细胞构成2种功能不同的绒毛1：由内层CTx外层ST构成的漂浮绒毛,负责母胎之间的物质转运；由内层CTx末端EVT构成的锚定绒毛,负责将绒毛锚定于内膜，同时直接接触母体蜕膜中的免疫细胞，参与母胎之间的免疫耐受。在胎盘形成初期，仅由CT,ST构成的绒毛称

5、原始绒毛。随后来源于ICM的中胚层结构进入初级绒毛内部，形成次级绒毛。随后中胚层结构形成血管，形成三级绒毛。同时，子宫内膜蜕膜化，ICM发育形成胎儿、脐带和羊膜。羊膜、绒毛及底蜕膜共同组成完整胎盘14o根据滋养细胞侵入子宫内膜的程度，胎盘可分为三类7,上皮绒毛膜型：滋养细胞不侵入子宫内膜，母胎血液完全分离；内皮绒毛膜型：滋养细胞侵入内膜上皮及间质组织，胎盘绒毛接触母体毛细血管；血液绒毛膜型：滋养细胞直接接触母体血液（图1）。人类胎盘为血绒毛膜型。图1不同的胎敌类型二 .传统研究方法1 .体内胎盘模型：在常用实验动物中，羊胎盘为上皮绒毛膜型，猫胎盘为内皮绒毛膜型,仅啮齿类、灵长类动物胎盘为血绒毛

6、膜型7o在结构方面，以啮齿类动物中最常见的鼠为例，其胎盘绒毛末端具有3层滋养细胞，不同于人类的单层ST（图2A、B）。在功能方面，以葡萄糖转运为例，鼠胎盘主要依赖葡萄糖转运侬glucosetransporter,GLUT）3,而人胎盘主要依赖GLT115o灵长类动物胎盘绒毛末端为单层滋养细胞，与人最为接近。但其胎盘在激素分泌等方面仍与人类有一定差异，且实验成本昂贵16。可见体内胎盘模型无法满足当下的研究需要。图2双胎盘.胎盆类器官及胎盘芯片与人胎盘的对比A示限胎盘.血绒毛腴型.城E末端包含3层滋养细胞；H示人胎盘.Ifil绒E膜型,绒毛末端为单层滋冰细胞;C示胎盘类器官.外周为细胞滋养层细胞.

7、内部为合体滋养层细胞;D小胎盘器甘芯片,滋养细胞.半透胶-血管内皮细胞结构2 .离体胎盘模型：离体模型包括胎盘灌流模型和绒毛外植体模型7。胎盘灌流模型为建立体外循环的真实胎盘小叶，具有完整的胎盘结构，长期以来被认为是研究物质胎盘通透性的金标准17。但该模型均取自晚孕期胎盘，无法模拟妊娠早期胎盘形成及植入等过程，且标本获取困难，每个模型仅有数小时的有效使用时间，可重复性差。绒毛外植体模型为体外培养的绒毛组织，可取材自早孕期胎盘，在胎盘侵袭能力研究中有一定应用。但静态培养环境可导致滋养细胞失去部分正常表型7,故而该模型亦有较大局限性。3 .体外胎盘模型：体外胎盘模型的细胞来源包括绒毛膜癌细胞系、原

8、代滋养细胞及滋养层干细胞(trophoblaststemcellzTSC)7o目前已有超过20个滋养细胞系被构建18L但研究表明JAR.JEG-3细胞系在人白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)表达上与真实胎盘组织有所不同5,HTR-8细胞系侵袭能力与原代细胞存在差异12,可见细胞系并不能代表真实胎盘。原代细胞及TSC与真实胎盘差异较小，但在传统培养环境下原代细胞会迅速失去细胞表型。1998年TSC即被证实存在于胎盘外滋养层中19,直至2018年，Okae等20才成功从人类囊胚中提取出TSCo干细胞亦可从体细胞诱导而来，但人胚胎干细胞(embryonicstemcel

9、lzESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcellziPSC)均无法分化成滋养细胞。2020年LiU等21才首次成功使用体细胞重编程诱导获得了TSC,并证实其具有向ST、EVT分化的潜能。由此可见，体内、离体和体外三类传统研究模型均存在一定局限性，无法满足当前的研究需要。三.胎盘类器官1 .类器官的构建及培养体系的优化：上皮组织类器官可由3种细胞构建而成，即多能干细胞、组织碎片及组织中提取的具备分化潜能的单细胞8。2018年，Haider等22报道了首例胎盘类器官，同年Turco等5亦构建了胎盘类器官,2个团队使用的细胞均来自妊娠68周的人类早孕胎盘组织5,22

10、。尽管培养体系及操作细节有所不同，构建胎盘类器官的基本方法是一致的5,22:消化胎盘组织获得滋养细胞后，使用不含生长因子的Matrigel重悬细胞，并置于37OC环境中数分钟待Matrigel凝固，随后以含多种细胞因子的培养基包被Matrigelz常规培养。可见在胎盘类器官的构建中，Matrigel及细胞因子是培养体系的关键。Matrigel来源于鼠肉瘤组织,富含层粘连蛋白、IV型胶原等细胞外基质extracellularmatrixzECM)成分，广泛应用于各种类器官的培养23-24o而培养基中的细胞因子成分与干细胞的培养体系类似，包括纤维原细胞生长因子4(fibroblastgrowthf

11、actor4,FGF4)9,19、转化生长因子(transforminggrowthfactorzTGF)125x表皮生长因子(epidermalgrowthfactorzEGF)9,26及Wnt通路激动剂5,9,25等物质。这些物质与Wnt通路22、TGF-通路8,22、骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMP)通路27密切相关，在既往研究中被证实可促进包括TSC在内的细胞生长、增殖及分化。Turco等5逐一检验了12种促进上皮类器官增殖的物质，并从中筛选出了6种用于胎盘类器官的培养，分别为肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactorlHGF)、

12、烟酰胺、Y27632、BMP7x孕激素及前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)。在此基础上，主要成分为EGF.FGF.Wnt通路激动剂的滋养层类器官培养基(trophoblastorganoidmediumzT0M)被用于类器官的长期扩增,而主要成分为A83-01及NRG1的EVT分化培养基(EVTdifferentiationmediumzEVTM)被用于诱导类器官向EVT方向分化(表1)。Haider等22的研究亦证实，EGF、PGE2、A83-01对胎盘类器官生长具有促进作用，并提出R-脊椎蛋白(R-spondin1,RSP01)亦为维持类器官扩增、抑制分化所必需。表1

13、滋养层干细胞及胎盘类器官培养体系培养物种属细胞因子其他添加物细胞外基质TSC【鼠FGF4肝素EMFI细胞TSC(TXa)网鼠FGF4TGI,-l肝素【谷氨酰胺L-AA2P亚硒酸钠胰岛素碳酸氢钠HOH转铁蛋白氨酰胺MatrigelTSC人CHIR99021EGFA83-O1SB431542Y27632丙戊酸硫基乙醇FBSL-维生素CIlS-XBSA胶原IV类器官人CHIR99021EGF83-O1RSPOlHGFNogginPGE2N2B27谷氨酰胺HEPES缓冲液Matrigel类器官(TOM)人CHIB99021EGFA83-OIRSPOlFGF2HGFY27632PGE2N2B27N.乙酰

14、-L半胱氨酸I谷氨酰胺Matrigel类器官(EvTM)人83-O12-硫基乙醇BSAITS-XNRGlKnOCkOUI血清替代物Matrigel注:FGF4示纤维原细胞生长因子4；TGF-Bl示转化生长因子因；ECF示表皮生长因子；RSPOl示R-脊椎蛋白1;HCF示肝细胞生长因子；L-AA2P示L-抗坏血酸-2-磷酸镁；FBS示胎牛血清;BSA示牛血清门蛋n；PGE2示前列腺素E2；ITS-X示胰岛素-转铁蛋FI-硒-乙醉股；NRG示神经调节蛋AiTSC示滋养层干细胞;T()M示滋养层类器官培养基;I.VTM示EVT分化培养基;1示TX培养基去除FGF4、TGF-B1、肝素后即为诱导分化培

15、养基2 .胎盘类器官细胞成分的验证：类器官与原器官的一致性验证可分为细胞形态、分子标志、基因表达等几个方面。目前所报道的胎盘类器官均为实心类球形结构。类器官外层细胞均为单核，形态特征与CT细胞相符。内部细胞为多核，细胞表面有微绒毛形成，胞内可见丰富的分泌细胞器及分泌囊泡,这些特征与ST细胞相符5,22,提示在类器官的中心发生了CT细胞的融合分化(图2C)。既往研究证实ERRBxCDX2、FGFR2xAP-2xGATA3等转录因子在TSC及高增殖活性的CT细胞中高表达19-20,25,28;基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases2xMMP2)xHLA-G等与ECMx胶原形成相关基因在EVT中高表达20;而绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotrophin,CG)aCGs妊娠特异性糖蛋白1(pregnancyspecificglycoprotein1,PSG1)、神经胶质细胞缺失因子1(glialcellmissing1,GCM1)等雷体激素、肽类激素相关基因在ST细胞中高表达20。以上分子常被用于免疫荧光及免疫组织化学检测