免疫自动化仪器分析.ppt

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1、 免疫检验自动化仪器分免疫检验自动化仪器分析析第一节第一节 自动化免疫浊度分析系统自动化免疫浊度分析系统 一、免疫透射比浊法一、免疫透射比浊法 二、免疫胶乳比浊法二、免疫胶乳比浊法 三、免疫散射比浊法三、免疫散射比浊法 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用第四节第四节 自动化酶联免疫分析系统自动化酶联免疫分析系统第二节第二节 自动化发光免疫分析系统自动化发光免疫分析系统 一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪 二、酶联发光免疫分析仪二、酶联发光免疫分析仪 三、三、电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫分析仪 四、在临床免疫检测中的应用四

2、、在临床免疫检测中的应用第三节第三节 自动化荧光免疫分析系统自动化荧光免疫分析系统 一、时间分辨荧光免疫分析仪一、时间分辨荧光免疫分析仪 二、荧光偏振免疫分析仪二、荧光偏振免疫分析仪思考题思考题小结小结 免疫检验自动化免疫检验自动化 （automation of immunoassays)是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。进行。第一节第一节 自动化免

3、疫浊度分析系统自动化免疫浊度分析系统 免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（液中反应，形成小分子免疫复合物（19S19S19S），使反应），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液一定波长的入射光线通过抗原

4、抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。较，可确定标本中抗原含量。一、免疫透射比浊法一、免疫透射比浊法（一）（一）原理：原理：1.1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）仪器工作过程（二）仪器工作过程 2.2

5、.将待测标本和标准抗原溶液（将待测标本和标准抗原溶液（5 5个浓度抗原标准个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在原抗体反应完成后，在340nm340nm处测定各管吸光度。处测定各管吸光度。3.按按log-logit转换或转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线方程进行曲线拟合，制备剂量拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。出抗原浓度。（三）方法评价（三）方法评价 优点优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确 不足不足:

6、抗体用量较大；抗体用量较大；溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为（一般为0.2 m），），在在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚粒凝聚，使，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：透射光和散射光即出现显著变化。

7、如图所示：a a为单个为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，胶乳颗粒不阻碍光线透过，b b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。使透射光减弱或散射光增强。二、免疫胶乳比浊法二、免疫胶乳比浊法（一）（一）原理：原理：（二）方法评价（二）方法评价 本法敏感度大大高于普通比浊法，可达本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可可与与IgG Fc段结合，使段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用性凝集，用F(ab)2片段代替片段代

8、替IgG既可消除此干扰，既可消除此干扰，又可克服又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。自凝或抗体活性降低会严重影响结果。粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：因素密切相关，其公式如下：三、免

9、疫散射比浊法三、免疫散射比浊法(一一)原理原理 式式I 中为与入射光成中为与入射光成角处散射光强度；角处散射光强度；和和I0为入为入射光的波长和强度；射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；为颗粒分子量；c为为浓度；浓度；N为阿佛加德指数；为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离；为颗粒到检测器的距离；为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。II042（dn/dc)2 Mc(1+cos)N24定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入定时散射比浊法是在保证抗体过量的

10、情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应在开始反应7.5s2min内的第一次读数，专门在抗内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。最低。(二二)定时散射比浊法（定时散射比浊法（fixe

11、d time nephelometry）1.1.仪器测定技术要点仪器测定技术要点(1)抗原抗体预反应阶段抗原抗体预反应阶段(2)反应阶段反应阶段(3)信号检测信号检测 2.2.抗原过量检测抗原过量检测(1)抗体适当过量抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定对抗原过量进行阈值限定 定时散射比浊法测定原理示意图定时散射比浊法测定原理示意图 BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复

12、合物累积的量），成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅每项检测仅12min即可完成。即可完成。(三三)速率散射比浊法速率散射比浊法（rate nephelometry）仪器测定技术要点仪器测定技术要点 开启机器，进行定标开启机器，进行定标 反应阶段反应阶段 抗原过量检测抗原过量检测 抗原抗体复合物形成的速率抗原抗体复合物形成的速率累计时间（累计时间（s s）形成形成ICIC总量速率总量速率累计时间（累计时

13、间（s s）形成形成ICIC总量速率总量速率 5 5 8 81010 13 13 5 51515 25 2512122020 60 6035352525 150 15090903030 230 23080803535 300 300 70704040 360360 60604545 415 415 55555050 450 450 45455555 480480 30306060 500500 2020抗原抗体反应速率的动态变化抗原抗体反应速率的动态变化IMMAGE全自动特定蛋白分析仪全自动特定蛋白分析仪(三三)方法评价方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本散射比浊法是目前临床应

14、用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质对抗体的质量要求很高。量要求很高。1.抗原抗体比例抗原抗体比例 2.抗体的质量抗体的质量 3.增浊剂的使用增浊剂的使用（一）免疫比浊分析的影响因素免疫比浊分析的影响因素 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用 4.伪浊度伪浊度 5.入射光光源和波长入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位结果报告中的计量

15、单位 7.标准曲线制备与质量控制标准曲线制备与质量控制（二）临床应用（二）临床应用 免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、链、免疫球蛋白亚类；补体链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血；血浆蛋白如前白蛋白浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶(1-AT)、2-微球蛋白微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白、结合珠蛋白(HP)、，、，C-反应蛋白反应蛋白(CRP)、载脂蛋白、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白、脂蛋白(a)、类风湿、类风湿

16、因子因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。第二节自动化学发光免疫分析系统第二节自动化学发光免疫分析系统自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘盘(盒盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。成。吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。原夹心法和竞争结合法等相同。一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪 Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y