2023基于实时荧光定量PCR技术的肿瘤分子病理检测临床实践中国专家共识(完整版).docx

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1、2023基于实时荧光定量PCR技术的肿瘤分子病理检测临床实践中国专家共识(完整版)摘要基于实时荧光定量PCR(qPCR)技术的肿瘤分子病理检测具有操作简便、报告周期短、灵敏度高、结果判读标准化等优点。然而,在临床实践中，qPCR技术的性能验证、质量管理、异常结果处理等问题相对复杂,缺乏统一规范和标准。因此，专家共识旨在从qPCR检测全流程角度，对影响检测结果的重要环节、检测过程中遇到的常见问题及异常结果判定及处理等提供规范化意见，达成基于qPCR技术的肿瘤分子病理检测临床实践中国专家共识，以规范检测流程并提高结果准确性，促进技术发展和更为广泛的临床应用。【关键词】肿瘤；实时荧光定量PCR;分子

2、检测；分子病理；专家共识恶性肿瘤分子病理检测是个体化治疗的前提和基础。目前，我国常用的分子病理检测平台包括实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCRzqPCR)、荧光原位杂交、Sanger测序和高通量测序等，其中qPCR技术具有操作简便、耗时短、灵敏度高等优势。qPCR技术利用不同波长的荧光基团标记探针，动态监测反应管中的荧光强度,形成PCR扩增曲线，间接反映靶基因扩增产物含量，从而对靶基因变异情况进行定性或半定量分析。目前,常见的qPCR技术包括扩增阻滞突变系统PCRs逆转录qPCR、多重连接依赖性探针扩增PCR技术和数字PCR技术等,能够对基因点突变、插入缺失、融

3、合等进行检测。qPCR技术近年来在肿瘤分子病理检测领域得到广泛应用，检测标准化和规范化对提升肿瘤分子病理检测水平和促进个体化诊治具有重要意义。本共识由具有丰富理论和检测实践经验的病理、分子病理专家共同发起并制定，旨在为qPCR技术检测实践提供指导和帮助。本共识包括qPCR检测技术的样本选择、前处理、检测流程、性能验证、质量管理、常见问题和异常结果处理等多个临床实践重要部分，推荐意见基于国内外临床实践数据并结合我国国情，分为强烈推荐（证据充分且专家组达成一致共识，在检测条件充分的环境下优先推荐开展的措施）、推荐（证据较充分且专家组达成基本一致共识基于特定实际检测条件推荐开展的措施）和不推荐3个等

4、级。共识制定计划已在国际实践指南注册平台（http:/www.guidelines-registry.org/）注册（注册号:PREPARE-2023CN093）o一、样本选择与前处理目前肿瘤分子病理检测常用样本主要包括福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin-fixedparaffin-embedding,FFPE）样本（包括手术切除f口活检组织样本）、细胞学样本和体液样本（包括外周血、脑脊液、浆膜腔积液上清液、唾液和尿液等），应依据临床需求、样本可及性及qPCR检测平台性能选择合适的样本。（一）样本选择强烈推荐使用手术切除组织或活检组织FFPE样本。组织样本不可及时，推荐采用细胞学样本进

5、行检测。若组织和细胞学样本均不可及，推荐外周血等体液样本进行循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA,CtDNA）突变检测。（二）样本前处理不同类型样本的前处理应根据各自特点建立标准操作程序（Standardoperatingprocedure,SOP）,详尽规范样本采集、运输、接收/拒收、保存和前处理流程，确保样本符合后续检测要求。1 .组织学样本：标本离体后应在30min内浸泡于1015倍体积的4%中性甲醛（10%福尔马林）固定液中，大样本应注意逐层切开以充分固定，根据样本大小和组织类型适当调整固定时间，一般不超过72h。样本浸蜡和包埋温度一般在58-60oCf不宜过高。2

6、.细胞学样本：包括胸/腹腔积液、心包积液和细针穿刺标本等，强烈推荐将细胞学样本制备成细胞蜡块，使用4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液或者95%乙醇固定，后续操作可参照组织样本处理要求及病理质控。也可将细胞学样本涂片或液基细胞学制片，镜下评估肿瘤细胞数量及比例，对于质控合格的细胞学样本，收集细胞沉渣，直接裂解提取核酸。止匕外，浆膜腔积液离心后的上清液可作为一种补充检测样本，用于分子病理检测，但应关注其假阴性风险，必要时可与细胞沉渣的检测结果相互验证。3 .体液样本：外周血是分子检测最常用的体液样本，主要通过分离血浆中CtDNA进行分子检测。可使用含有游离DNA保护剂和防细胞裂解剂的专用采血

7、管，采集不少于IOml的全血。前处理时，采用先低速后高速的二次离心法分离血浆。其他体液样本可参考外周血样本采集、保存和前处理方法。强烈推荐将体液样本与组织样本的前处理和核酸提取等操作分别在相对独立的物理空间（独立生物安全柜或实验室房间）进行。（三）样本质量评估在核酸提取前,应对组织和细胞样本的前处理过程、保存情况及细胞成分进行评估。对于体液样本，应对患者治疗情况及疾病状态进行评估。1 .组织或细胞学样本：推荐使用2年以内的FFPE样本,病理医师须对肿瘤细胞含量进行评估，推荐采用肿瘤细胞不少于200个，且占比不少于20%的蜡块,避免使用强酸脱钙处理后的样本，避免选取存在组织自溶、退变、大片出血、

8、明显坏死或结构不清等情况的蜡块。在应用qPCR检测结果辅助诊断时（如IDH1/2基因突变用于低级别胶质瘤与胶质细胞增生的鉴别诊断、BRAF基因突变用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断等）可备注可疑肿瘤细胞含量。肿瘤细胞含量低于质控标准时，应与临床医师和患者及时沟通，评估是否有条件重新采集样本；如果无法重新采集，可在获得患者知情同意后再继续检测，尽量富集肿瘤细胞，并在报告中注明质控情况及出现假阴性结果等潜在风险。目前获批的qPCR检测试剂盒的质控指标多是建立在检测大样本的场景之下，小样本（如粗针穿刺和活检夹取样本等）和细胞学样本的肿瘤细胞含量常低于试剂盒给出的有效检测范围，实验室可自行建立质控评价标准和

9、检出限。2 .体液样本：推荐治疗间期采集，如在化疗、放疗或手术治疗12周后采集。尽量避免在患者伴随其他疾病如严重感染或外伤时采集，以避免因正常细胞释放DNA对CtDNA稀释,造成假阴性结果。外周血应避免使用发生严重溶血或血脂过高等异常样本。（四）样本获取、富集、运输与保存FFPE样本切片前应保证切片机擦拭洁净无污染物，切片时每个样本使用单独的一次性刀片、一次性银子和棉签等耗材，防止不同样本间交叉污染。对于肿瘤细胞占比20%的样本，推荐对肿瘤细胞进行富集。石蜡切片和蜡卷可室温运输或短暂保存,推荐保存时间不超过2周。体液样本（胸腹水、心包积液和脑脊液等）需要尽快处理，若不能及时处理建议28OC下保

10、存不超过24ho外周血样本若选用专用采血管可常温运输保存，时间不超过7d,若选用EDTA抗凝管采血，推荐采血后2h内完成血浆分离。分离后的血浆，可暂存于-20（不超过1周）或-80（可保存1个月以上）,建议1周内完成后继检测。推荐剩余生物样本和核酸等进行分类保存，以备后续检测发现问题时追溯原因。二、检测流程与结果分析1 .核酸提取：目前，临床常用的核酸提取方法有吸附柱法和磁珠法，各个实验室可以根据自身实际条件，选择合适的提取方法和试剂盒，推荐采用经国家药品监督管理局（NatiOnalMedicalProductsAdministration,NMPA）注册/备案的商品化试剂盒，若采用实验室自建

11、试剂或其他核酸提取试剂，应进行性能验证，以确保能够达到临床应用要求。2 .核酸质量评估:核酸质量是qPCR检测结果准确可靠的前提，因此在进行qPCR检测前,需充分评估核酸总量、浓度和纯度等指标。推荐使用紫外分光光度计进行检测合格的DNA吸光度（八）值260/280比值在1.8左右（T殳在1.7-2.0之间），合格的RNAA260/280比值在2.0左右（一般在1.82.1之间）。核酸总量和浓度应符合后续qPCR检测要求。不符合质控标准的核酸样本应重新进行核酸提取。若样本不足且无法重新采集时，可尝试进行qPCR检测，并在报告中注明核酸质控情况及对结果的潜在影响及风险。3 .qPCR检测与结果分析

12、：强烈推荐采用经NMPA注册/备案的商品化试剂盒进行qPCR检测，并根据试剂盒说明书和实验室实际情况建立qPCR检测SOPo配制PCR反应体系时，应注意以下几点：根据试剂盒要求将样本核酸稀释到规定浓度范围。核酸质量差的组织/细胞学样本可适当提高核酸加样浓度。CtDNA不推荐稀释后加样，推荐用提取后原液进行核酸加样。（2）加样前，检测试剂应完全融化并充分震荡混匀，瞬时离心后备用。融化试剂可28OC暂存（建议不超过24h）,避免反复冻融。（3）加样时，避免移液器反复用力吹打，以减少气泡和核酸机械损伤。（4）加样完成后，将PCR管瞬时离心，分散对称放置于PCR仪内，避免仪器热盖加压时受力不平衡，按照

13、SOP设置扩增程序。qPCR扩增完成后，先确认阴性质控和阳性/弱阳性质控是否在控,再分析样本检测结果，对于处于临界值或灰区的样本，记录并分析可能原因，必要时需进行复检确认。4 .检测报告出具：各医疗机构应根据实际情况，设置符合规范的结果报告模版，由病理医师和分子检测人员协同及时、准确地完成分子病理诊断报告，为患者诊疗提供参考。共识推荐qPCR基因检测报告至少包括以下几方面内容：（1）患者信息及样本信息，包括患者姓名、性Slk年龄、门诊号或住院号、样本来源、样本编号或病理编号、临床诊断、病理诊断、样本类型、样本接收时间、样本病理质控和核酸质控信息等。（2）检测项目及方法,包括检测项目、检测方法和

14、仪器、所用试剂及其性能（如敏感度、特异度、局限性以及检测范围和位点等）。（3）检测结果，包括检测基因变异位点与检测结果。基因变异位点命名推荐使用人类基因组变异协会命名方法。检测结果推荐以”检出“或“未检出”来表述检测基因是否“存在“或“不存在”位点变异。如有其他意见或建议可以在结果中注明。（4）局限性说明，检测结果后建议增加备注内容，以说明检测的责任范围及局限性。报告审核和签发，qPCR检测报告须经具有分子病理诊断资格的授权签字人签名后，方可发出。三、质量控制为保证实验室的规范运行以及qPCR实验结果的准确可靠，应建立完善的质量管理体系。对实验室人员、仪器设备、试剂耗材、样本、实验方法、实验环

15、境以及检测能力等进行全面规范、验证和评估，建立相应管理制度、SOP及各种相关记录。规范质量控制活动，进行室内质控、室间质评和室间比对等，并对质量进行持续改进。试剂性能验证在正式开展qPCR技术相关的临床检测之前应完成性能验证或性能确认。使用NMPA注册/备案的qPCR检测试剂盒和相关耗材，在开展临床检测前需要进行性能验证，即实验室按照说明书操作，能复现生产厂家所宣称的检测性能。这里需要注意的是，当实验室利用试剂盒开展其预期用途以外的检测（如应用于非试剂盒规定的样本类型）或者更换系统内仪器或其重要部件以及改变试剂组分以及操作流程变化时，应参照实验室自建检测项目进行性能确认和日常管理。进行性能验证

16、时，推荐根据试剂盒说明书和检测项目实际情况，适当简化方案，侧重验证对检测结果有重要影响的性能指标，主要包括但不限于准确度、检出限、精密度、交叉反应和抗干扰能力等。1 .准确度：一般采用标准品和已知结果的临床样本进行验证，通过阳性符合率和阴性符合率进行评价。选取样本时，推荐包含阴性样本、阳性样本和弱阳性样本。阳性样本尽量覆盖试剂的预期测定范围，例如肿瘤突变检测尽量涵盖常见突变位点，并在后续日常检测中对预期测定范围进行持续关注和确认。2 .检出限：使用已知浓度标准品和稀释液，梯度稀释至检出限浓度，重复测定多次。评价该检出限浓度样本是否能稳定检出预期结果。3 .精密度：精密度包括重复性和重现性两个方面。重复性推荐使用一定数量的临床样本或标准品，在同样的条件下短时间内进行多次重复检测。重现性推荐使用一定数量的临床样本或标准品，在不同批次、不同日期由不同操作人员在多台仪器上进行多次重复检测。