【病毒学实验】第三次课3.4流感病毒的收获及血凝效价测定.ppt

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1、实验二 流感病毒的收获及血凝效价测定 第一部分 流感病毒的收获 实验目的 掌握从鸡胚尿囊腔收获流感病毒的方法,获得大量的病毒抗原。实验原理 将流感病毒接 种于鸡胚尿囊腔后,病毒就在尿囊的内 胚层细胞繁殖,繁 殖12天后,病毒颗 粒释放至尿囊液中,从而使尿囊腔中含 有大量病毒,通过收获尿囊液,可以得到较大量的流感病毒。实验材料及器械 1.已接种流感病毒的十日龄鸡胚 2.无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、无菌EP管(1.5和10mL各一个)3.75酒精棉球实验方法与步骤1.收获时间根据不同的病毒而异,流感病毒一般培养3648小时即可进行收获。收获前一天晚上,将鸡胚于4冰箱过夜(如果急于收获亦可于20放

2、置1小时左右),将鸡胚冻死,使红血球凝固,这样可避免在收获时流出的血细胞,同尿液或羊水里的病毒发生凝集,造成病毒滴度的下降。4 冷藏时间不宜过长,过长易造成散黄,影响收获。快速冷冻时间也不易过长,一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。2.经过冰冻的鸡胚用碘酒、75酒精消毒鸡胚气室部卵壳3.用无菌镊子将消毒过的壳打碎,轻轻揭去气室部位卵壳,撕去壳膜和绒毛尿囊膜,并将鸡胚轻轻推向一侧,压住。4.用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔吸出尿囊液(无大血管处轻轻吸取清亮的黄色液体)。收取的尿囊液可无菌小瓶第二部分 血细胞凝集实验测定流感病毒效价 实验目的 掌握血凝试验的方法和原理,了解流感病毒具有凝集鸡红细胞的能力

3、,掌握病毒类型的测定的一种方法。血凝原理血凝抑制原理实验材料及器械 1.收获的尿囊液(即流感病毒)2.1%鸡红血球、0.85生理盐水3.血凝板、吸管、三角瓶实验方法及步骤1.第1孔加入0.4ml尿囊液,第2孔加入0.1ml 尿囊液。2.吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔,从第3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。3.反复吹打34次第2孔,从混匀的第2孔中丢弃0.2ml,吸取0.4ml至第3孔混匀,再吸0.4ml至第4孔,依次稀释到第9孔,第9孔经稀释吹打后吸出0.4ml,弃去,第10孔为血球对照,即不加尿囊液。以上各孔(从第1孔到第10孔)的病毒的稀释度分别为:孔孔数数123456789

4、10稀稀释释度度病毒原液1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280空白对照注意:各孔内液体量应为0.4ml4.从第10孔开始,按10-1的方向,向每孔加0.4ml 1鸡红血球,轻轻振荡均匀,置室温45分钟后观察实验结果并记录,各孔的总体积应为0.8ml。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10病毒原液 红细胞对照 依次加入0.4ml 1鸡红血球实验结果判断 血凝结果以+、+、+、+、表示。红细胞均匀分布于孔底者为+;红细胞均匀分布于孔底,但有卷边现象为+,即不完全凝集;红细胞在孔底形成一个中等大小环状,四周和中心有凝集以两个加号+表示。红细胞在孔底形成一个小团,

5、边缘光滑圆润者为,红细胞完全未被凝集;实验中应注意的一些问题 1.实验所使用的玻璃器材及有机玻璃板均应干净,血凝板使用完毕及时处理,避免残留的酸、碱和沉着的红细胞影响实验结果 2.流感病毒是对温度比较敏感的病毒,标本置于20时在一两个星期内会出现病毒效价减少的现象,一般需要在70 存放。3.一般采取公鸡的红细胞,而且存放时间超过一周就不可再用。红细胞采来后用PBS洗3到4遍,直到上清很清亮,放置后如果上清变红,说明有溶血,则不可再用。4.温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血,不利于判定。反应的时间不能太长,对照孔出现沉淀就可以判定。思考问题思考问题加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加?血凝试验设置空白对照的意义?病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍数如十倍比稀释?

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