实验动物 实验用猫微卫星DNA检测操作规程.docx

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1、ICS65.020.30CCSB44实验动物学会团体标准T/CALASxxx-202x实验动物实验用猫微卫星DNA检测操作规程1.aboratoryanimal-OperatingprocedureformicrosatelliteDNAdetectioninexperimentalcat（征求意见稿）202x-xx-xx 发布202x-xx-xx实施中国实验动物学会发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则，GB/T20001.4-2015标准编写规则第4部分：实验方法标准的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别

2、专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：吉林大学。本文件主要起草人：丁瑜、袁宝、任文陟、胡进平、陈健、高安崇、高妍、张嘉保、刘殿峰、张金玉。实验动物实验用猫微卫星DNA检测操作规程1范围本文件规定了实验用猫微卫星DNA检测的原则性要求，包括猫采血的基本要求、实施条件、操作流程、档案管理。本文件适用于实验用猫微卫星DNA检测操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版

3、本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14923-2010实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制T/CALAS5I-2017实验动物豚鼠微卫星DNA检测方法3术语和定义以下术语和定义适用于本文件。3. 1实验用猫ExperimentaICat用于科学研究、教学、检定、育种以及其他科学实验的猫类。动物伦理AnimalEthics在实验动物生产、使用活动中，人（实施者）对实验动物的伦理态度和伦理行为规范。动物福利AnimalWeIfare动物生产、实验等过程中，满足动物基本的自然需求。包括但不限于动物生理福利、环境福利、卫生福利、行为福利、心理福利。微卫

4、星DNAMicrosateIIiteDNA是一种简单串联重复DNA序列，重复单位只有16bp,由1050个重复单位串联组成。又称为短串联重复序列（ShortTandemRepeat,STR）。4实施条件a）实验需严格遵守实验动物3R原则b）实验样本采集实验用猫血液或毛发即可（推荐采集毛发）5操作流程3.1.1 用于毛发采集密封袋、乳胶手套、口罩、头套、实验服、记号笔、实验记录本。3.1.2 用于血液采集酒精棉球、脱脂棉球、合适的止血带、剪毛剪、一次性使用静脉采血针（21G）、一次性使用真空采集管（肝素管）、伊丽莎白圈、乳胶手套、口罩、头套、实验服、记号笔、实验记录本。5. 2样本采集5.1.1

5、 毛发采集直接拔取毛发，放置于密封袋内，并做好标记。防止不同样本动物毛发混杂。5.1.2 血液采集1 .动物保定：适当的保定可减低动物的恐惧、焦虑及疼痛，也可保障操作人员的安全。2 .选择实验用猫的前肢或后肢，在近心端用合适的止血带扎紧，前肢扎在肘关节后面,后肢扎在踝关节上面。3 .在前肢的臂部或后肢的掌部需要采血的部位用酒精棉球消毒，用拇指掌面感受怒张的血管，必要时可以沿着血管进行剪毛。（如果血管怒张不明显，可以用酒精棉球将采血局部浸湿以促进血管怒张，或可先松开止血带，轻柔采血部位再扎上止血带）。4 .使采血针与血管呈45度，进针后见血将针放平沿血管走向往前进针，运针过程中会有一种比较轻松的

6、感觉。5 .采血管连接采血针并松开止血带，待采集适量血液后拔出采血针并使用脱脂棉球止血。6 .上下轻轻颠倒使血液与肝素钠充分混匀，防止血液凝集。5.3DNA提取提取基因组DNA：可采用苯酚-氯仿法或试剂盒提取基因组DNAo5.4 PCR5.4.1 PCR扩增体系PCR总体系为20L,其中2XT叫PCRMaStermiX取10L（或者IoXPCRBufferBZ2LTaq酶5UL取0.2LdNTP各2.5mM取IgL、MgCl2终浓度为L5mM）,上、下游引物（10pmolL）各lL,50100ng基因组DNA取lL,ddH2O补齐至20L0组成成分体积10PCRBuOer(Mg2+Plus)2

7、LTaq酣(5UL)0.2LdNTP(各2.5mM)lL上游引物(IOPmolL)lL下游引物(IOPmOIL)lL基因组DNA(50-100ng)lLddH2O13.8L总体积20L5.4.2 PCR反应程序95。C预变性，5min；94。C变性，30s；退火温度(各位点退火温度参见附录1),30s：72。C延伸,30s；35个循环；72。C继续延伸,7min；4。C保存。945min9430s7272、见附表/30s7min30s4保持35个循环5.5 电泳5.5.1 制胶：制备1%低熔点琼脂糖凝胶。5.5.2 点样：PCR扩增产物和DNAmaker各取5L,使用移液器点样于加样孔中。5.

8、5.3 跑胶：电泳仪电压设置为120V,电泳30min5.5.4 成像：紫外凝胶成像分析系统观察记录检测结果并拍照。6检测结果判定(I)实验用猫SSR位点等位基因和基因型的判定：对聚丙烯酰胺电泳图，用基因分型软件进行分析，确定特定位点各个体的条带和大小，判定该个体的等位基因数和基因型。(2)杂合度分析和Hardy-Weinberg平衡：根据基因和基因型的结果，用遗传分析软件进行处理，计算各位点的平均杂合度，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。7档案管理对实验用猫血液采集的详细情况进行记录归档，记录内容包括：操作日期、猫的种类、性别、实验项目、曾用何种特殊处理、血液采集量、采集人等信息进

9、行标注。(归档表格参见附录2)8编写背景DNA多态性是实验动物遗传检测的重要手段，在动物的基因组中发现了许多的简单重复序列，因此其重复单位比小卫星DNA短，故称为微卫星DNA(microsate11iteDNA),又称短串联重复序列(ShortTandemRePeat,STR),由MieSfeld等人于1981年研究DNA多态性标记过程中发现的。微卫星DNA重复单位以二甘酸重复单位(CA)n和(TG)n最为常见，然而重复单位的重复次数并不固定是可变的，一般为1020次重复，因而构成微卫星DNA多态性的基础。微卫星DNA两端的侧翼区是相对保守的单拷贝序列，能使微卫星特异性地定位在染色体的某一特定

10、区域位置上。根据研究结果，制定出实验用猫遗传检测方法，可用于其遗传质量控制、遗传组成分析和品系鉴定等。随着实验需要的增加，目前实验用猫的使用数量也在逐年攀升。然而国内尚无实验用猫近交系的公开报道，虽全国有多个封闭群，但缺乏分子遗传质量控制标准。随着行业快速发展及实验动物标准化，采用先进的技术进行实验动物的遗传质量控制是行业发展的必然趋势。国家标准GB14923-2010实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制中要求对封闭群动物的遗传质量进行生化标记基因检测，具体检测方法推荐使用DNA多态性检测方法。国家标准GB14927.1-2008实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法中仅对小鼠、大鼠的遗传检测

11、进行说明，并无实验用猫的生化和DNA检测方法说明。因此本标准的制定可以作为实验用猫的DNA检测方法用于实验用猫的遗传检测。目前国际标准即为采用生化标记方法，也采用DNA多态性方法，该标准的制定对于我国实验用猫标准达到国外先进标准具有重要的借鉴与推动作用。本单位目前正在培育英国蓝色短毛猫(英短，FeliSSiIVeStriSCatUS)封闭群，为了保障品系的遗传稳定性。因此，引入SSR进行这些品系/支系的遗产评价使其标准化，将为此后的研究和应用提供基础支撑，为我国实验用猫质量检定提供范例。9微卫星SSR引物的筛选与确定从加州大学圣克鲁兹学院GenOmeBrowserHome(http:/geno

12、me.ucsc.edu/)网站的数据库中随机查找核心为AC、GT重复序列的豚鼠微卫星DNA,用软件设计引物。从备选的78个微卫星位点中筛选了31个微卫星位点，用作标准。(引物序列参见附录1)10本标准常见知识问答10.1 什么是微卫星DNA?答：微卫星DNA(microsatelliteDNA)是一种简单串联重复DNA序列，重复单位只有l6bp,由1050个重复单位串联组成。又称为短串联重复序列(ShOrtTandemRePea3STR)o10.2 微卫星位点的选择依据？答：操作方便，多态性丰富，尽可能多地覆盖染色体组。10.3 什么是哈代-温伯格定律？答：如果一个群体符合哈代-温伯格定律(H

13、ardy-WeinbergIaW),那么这个群体各代之间的等位基因频率应该没有变化；如果一个群体一开始处在不平衡状态，那么经过一代的随机交配就足以使其达到遗传平衡，即等位基因的频率不变，而且只要符合这个规律依据的条件，该群体就会保持遗传平衡状态。11其他说明11.1 国内外同类标准分析本标准在制定时，充分借鉴了国家自然科技资源共性描述规范和实验动物共性描述规范的基本内容与总体要求,基本上代表了我国自行培育的实验用猫的质量控制、保种繁育的要求和水平。11.2 与法律法规、标准关系实验动物管理条例、实验动物质量管理办法、关于善待实验动物的指导性意见中的有关条款与本标准内容无冲突。11.3 重大分歧

14、的处理和依据无由于本标准为首次制定，因此还需要经过长时间的实践和检验来逐步完善，建议中国实验动物学会组织宣传贯彻和培训。附录1（规范性附录）实睑用猫微卫星位点引物序列及退火温度序号引物序列（5,T3，）退火温oc序号引物序列（5,T3，）退火温度/1GgaaacttggaaagcaaaaccTccacagttggagttcttaagg582GatctcacacttcatgggactgActgcatcccaaaggttttg603TgaaggctaaggcacgatagaCggaaagatacaggaagggta584TtaattgtatcccaagtggtcaTaatgctgcaatgtagg

15、gca585TaggtgaatgttgggatttatggAactgaagaccaaattgatgag556GagcccactctggacgtttcCatgggctaagaggccagta607TgagggtgagatggaaggagActaaccaatcctggtggtcc598CtagttgaaggggccagcacTctgtccagcccataggtgt599CaagggtctttggagcctgtGggtagtgtgaagtcagggt5710AaaagccctgacacccaagCttgaccttaattgctcattgg5811TtgaccctcataccttctttggTgggagaataaatttgcaaagc5812TggcccattaagcaagaaggtTggctatgccagcag