实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法》征求意见稿.docx

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1、国家标准实验动物近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法编制说明一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等；1、任务来源:TCS281项目（2019101854）2、牵头单位：中国食品药品检定研究院（下简称中检院）3、协作单位：上海实验动物研究中心（下简称动研中心）、广东省实验动物监测所、山西医科大学、北京维通利华实验动物技术有限公司、北京擎科生物科技股份有限公司、北京云菱计量检测有限公司、上海铮思为生物科技有限公司、陕西省中医药研究院（下简称陕中医）、陕西省实验动物质量监督检测中心（下简称陕质监）、杭州医学院、苏州苏大卫生与环境技术研究所有限公司（下简称苏

2、大研究所）4、主要工作过程：（1）“近交系小鼠SNP标记检测法”起草主要流程：2019年4月25日，中检院会同广东实验动物检测所、北京维通利华实验动物技术有限公司在北京召开了实验动物遗传国家标准修订第一次工作会，初步确定了小鼠SNP检测法方法验证方案。2019年5月中旬，通过国家标准委员会质量工作组专家邮件返回投票，通过了实验动物近交系小鼠SNP标记检测法立项。2019年5-6月，通过资料查阅、技术方法调研及前期实验结果，起草了实验动物近交系小鼠SNP标记检测法，并成立了标准工作组，进行任务分Io2019年6月至2020年4月在上述3家单位进行了标准方法验证。选择BALB/c、C57BL/6小

3、鼠DNA标准样品各2份，抽取了35个位点中的18个进行PCR扩增和一代测序验证。测序结果比对一致（第一次）。2020年5月29日，在钉钉线上答辩会上，标委会专家对标准草案进行了讨论并提出修改意见。2020年6月至2020年7月，按照专家意见完成了标准稿的修订。2020年7月至2021年3月，中检院与动研中心进行了标准研究合并，并由动研中心完成了标准方法的二次验证，测序比对结果一致。比对中同时发现，对于一代测序普通Taq酶扩增效果更为稳定，因此在标准修订稿中增加了推荐使用普通Taq酶。2021年3月至2021年7月，进行结果的整理汇总及标准稿的再次完善。2022年11T2月，接到小鼠大鼠SNP标

4、准合并通知。参与上海牵头的大鼠SNPLDR方法的研究验证。同时，进行SNP一代测序法的研究。2023年1-9月，协助上海进行了LDR方法验证方案的讨论。筛选了覆盖大鼠全染色体组的38个SNP位点，进行了一代测序方法的建立，同时，与北京擎科生物科技股份有限公司、北京云菱计量检测有限公司、上海铮思为生物科技有限公司签订标准方法验证协议，每家单位得到后述的小鼠样本2个，大鼠样本两个，各自平行完成5次扩增测序比对，全面进行了小鼠35个位点和大鼠38个位点一代测序方法的验证工作（第二次）。截至9月底，擎科公司已返回验证报告，云菱公司返回了验证结果。两者比对结果一致。上海铮思为公司的验证结果尚在整理中。（

5、2）“近交系大鼠SNP标记检测法”起草主要流程：2021年2-4月，动研中心因日常工作需要开展大鼠近交系种群遗传质量检测，通过资料查阅、技术方法调研及前期实验结果，起草了实验动物近交系大鼠SNP标记检测法。2021年4月中下旬，成立大鼠SNP检测方法标准工作组，动研中心向国家标准化质量委员会提交实验动物近交系大鼠SNP标记检测法草案。2022年11月11日，钉钉线上会议，近交系大鼠SNP检测法方法国标立项答辩，经国家标准委员会质量工作组专家合议，将近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法进行合并，合并为实验动物近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法。2023年2月27日，动研中心、中检院、陕中医，在腾讯会议

6、线上召开了实验动物遗传国家标准实验动物近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法合并后第一次工作会，初步确定了大鼠SNP检测法方法验证方案。2023年4-9月，动研中心、陕质监、杭州医学院、苏大研究所等4家单位进行了大鼠SNP检测标准方法验证。选择BN、Lewis大鼠DNA标准样品各2份，将19个SNP位点分为两组进行PCR扩增和LDR连接，然后进行毛细管电泳分型，验证3家SNP位点毛细管电泳分型结果比对一致，且毛细管电泳分型结果与一代测序结果比对一致。苏大研究所还未返还验证报告。2023年9月，进行结果的整理汇总及标准稿的再次完善。5、主要起草人及工作：岳秉飞：标准提案、研究指导、专家审评会答辩等；魏

7、杰：标准起草、实施标准验证方案，落实修订意见、专家审评会答辩等；赵莹：标准起草、实施标准验证方案，落实修订意见、专家审评会答辩等；王洪、赵丽亚、周佳琪、李欢、赵蓝，姚养正、汤建平、范春、陈国强、宋国华、王静：标准方法验证。二、编制原则、强制性国家标准主要技术要求的依据（包括验证报告、统计数据等）及理由；1、编制原则目前，有1个强制性标准和2个推荐性技术方法标准，分别如下：1个强制性标准：GB14923实验动物遗传质量控制，修订于2022年，推荐了使用分子生物学方法进行遗传质量监测，但没有具体技术方法。2个推荐性技术方法标准：GB14927.1实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法和GB1492

8、7.2实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法。这两个标准方法更新于2008年，分别采用了生化和免疫位标，是经典的遗传检测方法，但停留于20世纪中后期技术水平，与国际水平严重脱节。因此，需要建立国内适用、国际通行的近交系大鼠SNP检测方法和标准。本标准按照“科学性、规范性、可行性”的原则，依据中国国家标准标准化工作导则一第1部分：标准的结构和编写（GBT1.1-2009）规则起草。本标准规定了实验动物近交系小鼠单核甘酸多态性（SNP）标记检测方法，包括标准的范围、规范性引用文件、术语和定义、操作程序与结果判定等。2、验证分析方案、综述报告，预期效益；小鼠SNP验证方案与综述报告（第一次）：（1）

9、验证引物信息（表1）：P1P18上下游引物，每管各20L0表1验证引物标记名称及产物长度参考（第一次）序号SNP标记名称产物（bp）序号SNP标记名称产物（bp）1rs302279634410rs30233821892rs302282529911rs30234422973rs302288320912rs30234502164rs302297738513rs30893492995rs302306415314rs30234812506rs302317720015rs30896042907rs302320318316rs37096246738rs302322618517rs36597872779rs

10、302325118618rs3722313272产物以C57BL/6数据参考（2）验证模板信息（表2）：共4个，每品系2个表2品系模板信息（第一次）模板每管浓度均高于50ngLC57BL/62管(Cl,C2)25LBALB/cA2管(Bl,B2)25L(3) PCR扩增体系：PCR总反应体积为30L,其中含IOXPCRbuffer(Mg2+):3uL,上下游引物(10pmolL)各IUL,dNTP2.5mmolL:3uL,Taq酶5UL:0.2L,30ngL基因组DNA:IuL,纯水21.8uLo(4) PCR反应程序：96预变性，3min；96C变性,30s；60,Imin；72延伸，30s

11、；30个循环;72继续延伸8min；扩增产物4保存。(5)电泳及产物返回测序制备1*TAE制备2.5%琼脂糖凝胶，取PCR扩增结果5L,用移液器在凝胶上点样。110V,30mino凝胶成像系统记录检测结果并返回拍照结果。将电泳后有结果的产物寄回，统一测序。返回内容及信息包括：4个模板18个SNP位点的PCR产物管；PCR琼脂糖凝胶电泳结果图，以及PCR所用主要仪器试剂品牌型号信息。（6）综述报告按照标准项目要求和工作流程，经过标准立项、起草、验证、修改、再验证的过程，自2019年月至截至2021年7月，完成了全部4家单位的方法验证及结果分析以及标准修改稿。经验证，得到如下结果：C57BL/6、

12、BALB/cA每种品系2个样品所得结果一致;4家单位在18个SNP位点上的测序结果一致。比对结果详见表3,部分电泳和测序比对结果见图1、图2。表34家单位2个品系18个SNP位点比对结果（第一次）SNP位点品系单位C57BL/6BALB/cA广东监测所维通利华上海中心中检院广东监测所维通利华上海中心中检院rs3022796TTTTTTTTrs3O22825TTTTTTTTrs3022883AAAAAAAArs3022977CCCCTTTTrs3023034GGGGGGGGrs3023177CCCCAAAArs3023203AAAAAAAArs3023226TTTTCCCCrs3O23251TT

13、TTCCCCrs3023382TTTTGGGGrs3023442AAAAAAAArs3023450TTTTCCCCrs3089349GGGGAAAArs3023481GGGGAAAArs3089604TTTTTTTTrs3709624TTTTCCCCrs3659787GGGGAAAArs3722313TTTTCCCCC28182MCla8182ClC2BlB2ClC2BlB2IC2Bl82MQBl82P2二P3J一一I-ClC2B1B2C1C281B2中检院上海中心广东所维通利华图14家单位在rs3022825（P2）和rs3022883（P3）位点琼脂糖电泳图C57BL6（中检院）C57BI

14、6（W）CS7BL6（广东）C57BL6（雉通利华）BALBcA（中检院）BALBcA（上海）BALBcA（广东）BALBcA傩通利华）cGCTGGatggccac33CCtggtccaGTAtgatcaccatiCTGCTGGATGGCCA4a3CCTGGTCCAGTATGATCACCATlCTGCTGGATGGCCAd33CCTGGTCCAGTATGATCACCAT1CTGCTGGATGGCCA43CCTGGTCCAGTATGATCACCATI图24家单位2品系样品在rs3023450位点的测序结果小鼠SNP验证方案与综述报告（第二次）：（1）验证引物工作液信息（表4）:PlP35上游引物（F）,下游引物（R）。每管不少于50UL。