手足口病标本采集及检测技术方案.docx

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1、手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输C一）粪便标本。采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4C暂存12小时内送达实验室，-20C以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70C冰箱。（二）咽拭子标本。采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带

2、有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化,评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液。在手足口病的实验室诊断中

3、，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，一20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于一70C冰箱.（五）肛拭子标本。采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后，迅速将棉签放入装有3-5ml保存

4、液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为LO-2.0mL采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即（12h内）

5、送达实验室，一2OC以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于一70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录,肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊

6、断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：保存液Eagle飞液（MEH）80.5ml3%L-谷氨酰胺20OmMI.Oml胎牛血清5.Oml7.5%NaHCoa溶液3.5ml青、链霉素IOml（各00D0Ul）三、实验室检测操作流程（一）病毒分离。1.试剂配置（

7、1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维而KMMJ92. 5ml1. OmlEagles液（MEM）86.5ml3%L-谷氨酰胺20OmM1.Oml胎牛血清10.Oml2.Oml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、链霉素LOml1.Oml(各IooOOU/ml)(2)粪便标本和肛拭子的处理液完全PBS液中加入P.S溶液,终浓度为青霉素100单位/ml,链霉素为100g/ml0完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。A液：试剂品名加入量NACL&OOgKCL0.20gNaHPO(无水)0.91gKHjPO10.12g用60080O

8、ml蒸偏水溶解以上盐类，加蒸用水补至1000ml,IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液(不含钙、镁离子)。B液：试剂品名加入量MgCI*6乩O0.IOg溶解于IoOml蒸僮水中，IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌。C液：试剂品名加入量CaCl20+IOg溶解于100nlI蒸i水中,IOpsi(70Kpa)15分钟高压灭菌。2.病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒(如EV71、CVA16)生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVAI6等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEP-2细胞，来源于人

9、喉癌上皮细胞。3.标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入IomlPBS、Ig玻璃珠、ImI氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于一20（；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min;6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在150Og条件下离心20min;7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；8）1管粪便悬液冻存

10、于一2Ot作为备份，另1管存于4-8。C以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融）,使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，100OOrPm离心20min,用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4.接种和观察(病毒分离)(1)通常使用8ml的斜面试管培养细胞,传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单

11、层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；(2)倒掉生长液(GM),换上1-1.2ml的维持液(MM)；(3)每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEP-2细胞，正确标记每支细胞培养管(包括标本的编号、日期、传代数):(4)每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；(5)每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36。(或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液(GM),每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液(MM)o同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。(6)使用倒置显微镜每天

12、观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现(如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等)；(7)记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE(I+4+)、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化(1+,25%；2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%)；(8)如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化(3+CPE),然后储藏在一20以备二次传代；(9)第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后一2CTC或一70C冻存；(IO)一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保

13、存在-20C冰箱(二代病毒)。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；(11)如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。(注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代):(12)盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；(13)注意：如果接种后24h内出现CPE,很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取IoOUI阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐Ih后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；(14)几个概念：A：毒性反应：如果在接种后2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应

14、。这些已接种标本的试管应在-20C冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中(此时是第二代)。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE,那么认为这个标本是阴性的。5.

15、病毒分离结果解释RD细胞支持HFMD的主要病原体CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制,CVAl6和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应(CPE),表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVAI6和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVAI6,表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVAl6早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPEo若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但