医用供体猪 基因鉴定通则.docx

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1、ICS07.080CCSDH地方标准DBXX/TXXXXXXXX医用供体猪基因鉴定通则GeneraIprinciplesofgeneticidentificationformedicaIdonorpigs（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上.XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施发布/A刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省经济和信息化厅提出。本文件由四川省经济和信息化厅归口。本文件起草单位：本

2、文件主要起草人：医用供体猪基因鉴定通则1范围本文件规定了医用供体猪基因鉴定的总体原则及鉴定方法。本文件适用于医用供体猪的生产、引种、交付过程中基因鉴定。基因修饰动物的基因鉴定可参考本文件。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分

3、：动物组织样本预处理GB/T35537高通量基因测序结果评价要求GB/T38477基因表达的测定蛋白印迹法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。21医用供体猪medicaldonorpigs通过生物工程技术获得，用于提供医疗用途的活器官或生物材料制备的低免疫原性猪及其群体。基因修饰geneticmodification利用生物化学方法修改生物遗传物质，使生物产生新性状，修饰方式主要包括转基因、基因编辑介导的基因定点插入和基因敲除3种。注：医用供体猪常见基因修饰名称及种类见附录A-基因整合geneintegration将特定基因片段导入宿主基因组内的基因修饰方法，包括转基因和基因定点插入。基因

4、敲除knockout将特定基因片段从基因组中去除的基因修饰方式。基因修饰稳定性检测geneticmodificationstabiIitytest通过连续检测不同代数基因修饰动物基因型、基因表达情况来评估基因修饰在动物群体中遗传稳定、及表达稳定的手段。aa基因组结构变异structuralvariants；SVs在医用供体猪获得过程中，基因组上发生长片段（50bp）的序列变化和位置关系变化。注：基因组结构变异包括长片段序列插入或删除、串联重复、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、基因拷贝数变异以及嵌合性变异等。脱靶off-target与靶标不同的基因组位置和/或核酸序列。示例：结合脱

5、靶、切割脱靶、编辑脱靶、序列改变脱靶。注：编辑脱靶属于非预期编辑.来源：ISO5058:1-2021,3.1.4高通量测序high-throughputsequencing以一次并行几十万到几百万条核酸分子序列测定和一般读长较短等为标志，适用于DNA的测序技术。来源：35890-2018,3.14总体原则基因鉴定是医用供体猪制备过程中重要组成环节，医用供体猪制备、筛选、交付等过程应对其进行基因鉴定。因其用途的特殊性，医用供体猪基因鉴定应同时考虑安全性和有效性，降低因基因修饰技术引入的不可控因素。安全性和有效性评价应结合设计预期、基因修饰类型进行综合评估，鉴定项目可参考表%表1医用供体猪基因鉴定

6、评价项目序号鉴定/检测项目评价类型1基因型有效性评价2基因表达3遗传稔定性遗传稳定检测4基因组结构变异安全性评价5脱靶5鉴定项目及方法K1有效性评价5.1.1基因型鉴定5.1.1.1鉴定方法样本DNA提取可选用符合要求的商业化试剂盒进行提取，也可由实验室自建方法提取。引物设计应在目标基因（拟整合基因/敲除基因靶位）上下游设计引物，参考序列可在NCBl上获取。样本DNA提取后，进行质量检测，符合质量要求的DNA进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，观察目标条带判定是否符合预期。判定基因整合见5.1.1.2a）。判定目标基因的是否敲除，应将符合预期的条带回收，进行Sanger测序（见5.1.1.2

7、b）。注：基因整合鉴定示例见附录BLEA29Y基因有效性检测方法基因型鉴定部分，基因敲除鉴定示例见附录CGGTAI有效性检测基因型鉴定部分.5.1.1.2结果判定a）出现Fl标条带，则判定基因整合有效。b）目标片段测序结果和参考序列比对，靶位产生不为3的倍数碱基的插入和缺失,则判定基因敲除有效。5.1.2基因表达5.1.2.1检测方法选取与目标蛋白相结合的特异抗体对医用供体猪组织、细胞水平进行蛋白检测。可采用蛋白免疫印迹法、免疫组化/免疫荧光、酶联免疫吸附技术、流式细胞术等方法进行检测。建议根据不同生产工艺选择合适的检测方法，蛋白免疫印迹法可作为基础方法选用，蛋白免疫印迹法检测及判定方法可参考

8、GB/T38477o蛋白免疫印迹、免疫组化（荧光）、酶联免疫吸附技术检测示例见附录BLEA29Y基因有效性检测方法基因表达鉴定部分。流式细胞术技术检测示例见附录CGGTAl有效性检测基因表达鉴定部分。5.1.2.2蛋白免疫印迹法结果判定a）成像图片本底干净，能观察到转印膜均匀的轻微背景轮廓，目标条带清晰且不过曝，即可判定目标蛋白表达。b）基因整合类应有目标基因蛋白表达，敲除类应无目标基因蛋白表达。5遗传稳定性检测5.2.1通用要求医用供体猪自然繁育进行扩大化培养时应符合封闭群或近交系的育种方式，同时应检测基因遗传稳定性。5.2.2检测方法医用供体猪群体每代个体均应进行基因型鉴定和基因表达检测，

9、方法见5.1,应连续监测3代以上。5.2.3结果分析医用供体猪基因型鉴定及基因表达检测结果符合基因分离定律和自由组合定律，则认为具有遗传稳定性。S1安全性评价5.3.1染色体结构变异和脱靶检测在基因修饰过程中，存在染色体结构变异和基因修饰脱靶的风险，应对原代个体进行染色体结构变异和脱靶检测，评价安全性。采集医用供体猪基因修饰前后的血液或组织进行高通量测序，获取医用供体猪基因组序列信息，进行生物信息学分析。样本处理参照GB/T33681.1的要求执行，测序方法参照GB/T30989进行，测序质量控制参照GB/T35537执行。5.3.2结果分析a)染色体结构变异基因修饰前后，除基因修饰位点外，染

10、色体其他区域基因序列无差异，医用供体猪基因组未发生非预期基因片段插入、序列缺失、倒置、异位，则认为在医用供体猪制备过程中未引入基因安全风险。b)脱靶检测使用CaS-OFFinder(CRISPRRGENTools(rgenome,net)或类似算法模型工具，在猪基因组参考序列内匹配脱靶风险位点，允许SgRNA的靶标序列存在1个4个错配，医用供体猪脱靶各风险位点序列信息和基因组参考序列一致，则认为没有脱靶，反之则存在脱靶风险。附录A（资料性）医用供体猪常见基因名及修饰类型基因敲除GGTAlB4GALNT2B4GALNT2LCMAHPERVSLAclassIorB2M基因整合humanmembra

11、necofactorproteintransgenic(hCD46-Ig)humandecay-acceleratingfactortransgenic(hCD55tg)humanmembraneinhibitorofreactivelysistransgenic(hCD59tg)humancomplement-regulatoryproteinClinhibitortransgenic(hCl-INH-tg)HLA-EZhumanbeta2-microglobulintransgenic(HLA-EB2M-tg)humansignalregulatoryproteinalphatransge

12、nic(hCD47-tg)humanLEA29Ytransgenic(LEA29Y-tg)humanCTLA4-Igtransgenic(hCTLA4-Ig-tg)porcineCTLA4Igtransgenic(pCTLA4Ig-tg)humandominant-negativemutantclassIltransactivatortransgenic(CIITA-DS-tg)humanthrombomodulintransgenic(hTBMtg)humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-tg)humantissuefactorpat

13、hwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)humanectonucleosidetriphosphatediphosphohyd,o1ase1transgenic(hCD39tg)humanecto5,-nucleotidasetransgenic(hCD73tg)humantumournecrosisfactor-inducedprotein3(TNFAIP3)transgenic(A20tg)humanhaemooxygenase1transgenic(hHMOXltg)solublehumanTNFRI-Fctransgenic(ShTXFRI-FC-tg)来源：

14、ReichartB,CooperDKC,LanginM,TonjesRR,PierSonRN,WolfE.Cardiacxenotransplantation:fromconcepttoclinic.CarcliovascKes.2023Feb3;118(18):3499-3516.doi:10.1093cvrcvacl80.PMlD:36461918;PMClD:PMC9897693.附录B（资料性）LEA29Y基因整合有效性检测方法B.1LEA29Y基因型鉴定B.1.1原理以LEA29Y基因为靶位点，设计上下游引物，进行PCR检测。B.1.2样品准备B.1.2.1样品种类猪耳组织、血液等B

15、1.2.2样品采集耳样采集：在猪出生后尽快采集猪只耳样，以便及时获得新生猪基因型信息。采集耳样前，采样工具及采样部位做好消毒，使用耳标钳在猪耳朵上剪下耳组织，将耳组织放入1.5mL离心管中用于下一步基因组提取。血液采集：使用紫色采血管，采集猪全血3-5矶，采样前将猪只保定好，行猪颈静脉采血术。B.1.2.3样品处理使用基因组DNA提取试剂盒（简石生物，TD468）,提取样品总DYA。用于下一步的PCR实验。对于耳组织样品，提取总DNA前应对其进行研磨处理，已获得更高的浓度的基因组DNA。对于全血样本，应首先进行破红处理，去除全血中无核的红细胞后，提取白细胞总DYA,以提高基因组DNA质量B.1.3PCR反应B.1.3.1引物设计针对LEA29Y基因序列，使用引物设计软件或者网站设计特异性引物。本实验设计引物序列如下：上游引物：5,-GTACCCACCGCCATACTACG-3,；下游引物：5-GCGATGTCGCTGGGATAGAA-3上下游引物位置及扩增片段序列