超氧阴离子Oxygenfreeradical,OFR试剂盒说明书.docx

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1、超氧阴离子(OXygenfreeradical,C)FR)试剂盒说明书微法1T6S注意t正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定.刑定意义,生物体内超氧阴离广等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物大分r产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常,从而引起多种疾病。测定原理:超氧阴离广与盐酸羟胺反应生成NoZ,NO?在对氨基苯磺酸和a-蔡胺的作用下,生成红色的偶氮化合物,在53Onm处有特征吸收峰,根据A值可以计克样品中0?含量,反应式为NH2OH+202+HNO2+H2O2+H2Oo自备实验用品及仪器,天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿用

2、6孔板*氯仿和蒸谣水.试剂组成和配制:提取液:液体IlOmLXl瓶,4。保存。试剂一:液体20mLxl瓶,4e保存。试剂二:液体15mLxl瓶,4寸避光保存。试剂三:液体15mLxl瓶,4避光保存.试剂四:执仿,自备.超星阴离子提取:1.植物、动物组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入Imi.提取液)进行冰浴匀浆,然后,100OOg,40,离心20min,取上清置于冰上待测。2.细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):提取液体积(rL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,

3、间隔7秒,总时间3min):然后100OOg,4C,离心20min,取上清置于冰上待测.3.血清或培养液:直接测定。JM定操作表I分光光度计/酶标仪预热30min.调节波长至53Onm。1、操作表空白管测定管样本BL)200提取液(L)200试剂(L)160160混匀,37P水浴20min试剂二(L)120120试剂三(L)120120混匀,371C水浴20min试剂四L)200200混匀,8000g,25e,离心5min,小心吸取上层水相200ULr微量石英比色皿内6孔板中,测定A530。AA=A测定A空白,空白管只要做一管。超氨阴寓子含计算公式a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线

4、:y=0.0242x-0.0027.R2=0.99801.组织:(1)按照样本质量计算超氧阴离广含量(nmol/g鲜重)=(A+0.0027)0.0242V反总XV样W样总XW)X2=148.76(A+0.27)W超氧阴离广产生速率(nmolgmin)=148.76(A+0.0027)WT=7.44(A+0.0027)W=148.76x(A0.0027)T=7.44(A+0.0027)V样总:加入提取液体积,1mL;V反总:反应总体积,0.36mL;V样:反应中样品体积,0.2mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g:T:反应时间,20min;2:2分子02参与反应生成1分子NO2b用96孔板测定的计算公式如下标准曲线:y=0.0121x-0.0027.R2=0.99801.组织:1)按照样本质量计算超氧阴离子含量(nmol/g鲜重)=(AA+0.0027)0.0121xV反总(V样V样总XW)X2=297.52(A+O.OO27)W超氧阴离子产生速率(nmol/gmin)=297.52(A+0.0027)WT=14.88(A+0.0027)W注意事项:1、OD值大于1,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。2、样品制备好后,立刻进行测定,请勿将样品进行长时间的低温保存,以免影响测定结果。3,试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。

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