线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书.docx

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1、线粒体复合体In试剂盒说明书微法100*/96样注*:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义，线粒体复合体111(EC1.10.2.2)又称COQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、澈生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C.刑定原理：与林化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在55Onm有特征光吸收，因此55Onm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体IIl酶活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸憎水

2、。试剂的组成和配制：试剂一：液体100mLxl瓶，-2(TC保存：试剂二.：液体20mLkl瓶,-201C保存；试剂三：液体1.5mLxl支，-2(TC保存；试剂四：液体20mLxl瓶，4t保存；试剂五:粉剂I支，-2(C保存；试剂六：液体25ffiLKl瓶，-2OIC保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入ImL试剂一和IoUL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,4寸离心5min。3、弃沉淀，将上清液移至另一寓心管中，IlOOOg,4X：离心IOmin(I4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从

3、线粒体泄漏的复合体III(此步可选做)。5、步骤中的沉淀即为线粒体，加入200UL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次)，用于复合体III酶活性测定.湖定步事：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm,蒸情水调零。2、样本测定1)工作液的配制：将试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37C(哺乳动物)或25C(其它物种)孵育5min；用不完的试剂分装后.20匕保存，禁止反复冻融。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入K)UL样本、251IL试剂六和200UL工作液，立即混匀，记录550nm处初始吸光值Al和2min后的

4、吸光值A2,计算AA=A2-A1.重合体川活力单位的计算：a.使用雄石英比色IH测定的计算公式如下：（1）按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InnWI还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位.复合体In活力（nmol/minmgprot）=（AV反总+V反总+（cxd）xlO（V样XCPr）+T=1230*AA+Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。AAW3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生Inmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体In活力（nmolmin104CelIHAAXV反总+（d）109（500V样V样总）=0.4%AAV反总：反应体系总体积，2.35x10L；:细胞色素C摩尔消光系数，1.91x10*L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL:W：样本质量，gi500：细胞或细菌总数，500万.