流式细胞术基本原理.ppt.ppt

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1、流式细胞术流式细胞术 -原理、操作及应用原理、操作及应用教学参考书教学参考书 实用流式细胞术彩色图谱。实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4 临床流式细胞分析临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8 流式细胞术原理与应用教程流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.2 实用流式细胞术实用流式细胞术-血液病篇血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学出版社。2010.9 流式细胞术流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10主要内容主要内容 一、流式细胞仪结构和原理一、流式细胞仪结构和原理 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞

2、仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的光信号检测 流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式细胞术数据的存贮、显示与分析 流式分选流式分选 二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧 三、流式细胞术在生物医学中的应用三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计

3、算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；秒；检测结果：精度高、准确性好；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；可对目标细胞进行分选；流式：流式：单个细胞单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；分析，收集每个细胞的数据，更精准；WB：群体群体分析，得到多个细胞的平均值。分析，得到多个细胞的平均值。流式

4、细胞仪的发展及商品化流式细胞仪的发展及商品化 1934 Moldavanl:First try(固定式细胞分析固定式细胞分析-流动式流动式)；1953 Crosland-Taylor:鞘流系统鞘流系统(解决难题解决难题)；1956 Coulter原理原理(血细胞计数器血细胞计数器)；1965 Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置；等设计了细胞分选的装置；1969 Vandilla等等:第一台荧光检测细胞计第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)；1972 斯坦福大学斯坦福大学:

5、研制出荧光激活细胞分选仪研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪式细胞仪-FACS。1975 Kohler和和Milstein:单克隆抗体技术单克隆抗体技术(促进流式发展促进流式发展)。1979年年 国家科委重点项目：国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪；研制国内第一台激光流式细胞仪；1982年年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；1984年年 国家科委组织科研成果的鉴定验收；国家科委组织科研成果的鉴定验收；1985年年 获国家卫生部科技成果

6、乙等奖；获国家卫生部科技成果乙等奖；1985年年-1990年年 灵敏度灵敏度、信噪比信噪比、更多参数；更多参数；流式分选仪研制开发；流式分选仪研制开发；计算机四参数软件；计算机四参数软件；样品制备、医学生物学应用。样品制备、医学生物学应用。流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类 分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，还需要保持无菌状态，所

7、以分选型流式细胞仪一般只用于分选。式细胞仪一般只用于分选。BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪公司分选型流式细胞仪FACSVantage SEFACSAria IIIInfluxBeckman Coulter流式细胞仪流式细胞仪Epics XL 单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Ga

8、llios 三激光十色，分析型MoFlo XDP 高端分选型1.2 流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统 光学系统光学系统 激发光源激发光源 光束收集系统光束收集系统 电子系统电子系统 光电转换器光电转换器 数据处理系统数据处理系统 细胞分选系统细胞分选系统 喷嘴喷嘴 电偏转板电偏转板 样本收集器样本收集器1.2.1 液流系统液流系统 鞘流技术：根据层流原理发鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有

9、鞘液面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免了多个细胞重叠进入检测区。了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流细胞流激光照射点激光照射点流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图（一）（一）流动室流动室和和液流驱动系统液流驱动系统 流动室流动室(flow cell,flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过

10、，并在此与激光正交。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器流动室结构图：单细胞发生器液流驱动系统液流驱动系统（二）进样速率控制（二）进样速率控制10 psi10.2 psi10 psi10.8 psi 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。胞数就增加，这样会导致变异系数增

11、加。1.2.2 光学系统光学系统（一）（一）激发光源激发光源：激光器：激光器 气体激光器：氩离子气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪离子、氪离子 (647nm)、氪氩、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光泵浦的染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，发出光器，发出550-650nm可变波长激发光；可变波长激发光；半导体激光器半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。价格低、结构简单、寿命长。BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半导体激光器。半导体激光器。激光特点：单波长、高能量、小发射角

12、、高稳定性光照。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为根激光器，波长多为488nm、633nm和和355nm、405nmUV；（二）光（二）光束成行系统束成行系统FCMFCM的的单细胞照明技术单细胞照明技术：这种：这种椭圆形光斑椭圆形光斑的检测的检测区保区保证样证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。细胞流动方向细胞流动方向（三）光收集系统（三）光收集系统 滤光片滤光片的组成的组成 长通滤片长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤

13、片短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。：只允许一定波长范围内的光束通过。Long pass Short pass Band pass460 500 540460 500 540460 500 540FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统流式细胞仪信号检测系统 透射光路透射光路 全反射光路全反射光路FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统流式细胞仪器信号检测系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.2.3 电子系统电子系统 光电检测器光电检测器将光

14、信号转换成电子信号。将光信号转换成电子信号。前置放大电路前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统数据处理系统计算机系统数据采集、分析。计算机系统数据采集、分析。（一）（一）光电检测器光电检测器(photodetector)光电二极管光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；）；光电倍增管光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2

15、,FL3,FL4)。PMT前向散射光前向散射光光电二极管光电二极管（二）（二）电信号两种放大方式电信号两种放大方式 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用处理，一般信号的放大可以使用线性线性或或对数对数两种方式。两种方式。线性线性(linear;lin)对数对数(logarithmic;log)一般一般FSC和和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。变异范围较大，多使用对数放大。（三）（三）电脉冲信号的面积电脉冲信号的面积A、高度、

16、高度H和宽度和宽度WCreation of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0Quantification of a Voltage PulseWidth=Area/Height 光信号电信号数字信号光信号电信号数字信号 通道通道(channel)一个光电检测器一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管就是一个通道，有多少个光电二极管/倍倍增管，就有多少个通道：增管，就有多少个通道：散射光通道散射光通道:FSC通道和通道和SSC通道；通道；荧光通道荧光通道 通道命名方式：通道命名方式：以以FL(fluorescence)加数字命名，如加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。以该通道接收的主要荧光素命名，如以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm两根激光器，两根激光器，488nm能检测能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测能