大熊猫重要疾病检测技术规范.docx

《大熊猫重要疾病检测技术规范.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大熊猫重要疾病检测技术规范.docx（15页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、大熊猫重要疾病检测技术规范1范围本标准规定了大熊猫重要传染性疾病及寄生虫病的病原检测项目、病原检测方法、病原检测规则、结果判定和检测结论、废弃物处理等内容和要求；本标准适用于XX省大熊猫转运、健康监测、野外救护等病原检测方案。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T18646-2018动物布X氏菌诊断技术SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范DB51/T1710.4-2013

2、大熊猫检疫技术-犬冠状病毒实验室检测技术规范-RT-PCR方法DB51/T1710.5-2013大熊猫检疫技术-肠侵袭性大肠杆菌(EIEC.0152)的实验室检测技术规范DB51/T1710.7-2013大熊猫检疫技术-犬腺病毒实验室检测技术规范-PCR方法DB51/T1710.9-2013大熊猫检疫技术-蛛实验室检测技术规范DB51/T1710.10-2013大熊猫检疫技术-蠕形螭实验室检测技术规范DB51/T1710.14-2013大熊猫检疫技术-肺炎克雷伯氏杆菌的实验室检测技术规范DB51/T1710.16-2013大熊猫检疫技术-金黄色葡萄球菌的实验室检测技术规范DB51/T1710.

3、18-2016大熊猫检疫技术-乙型脑炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法DB51/T2387-2017大熊猫检疫技术-弓形虫检疫技术规范DB51/T2389-2017大熊猫检疫技术-隐抱子虫检测技术规程3术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction,PCR用一对寡核昔酸引物、四种脱氧核糖核甘酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2反转录ReverseTranscription,RT是DNA生物合成的一种特殊方式，以RNA为模板，通过反转录酶合成DNA。3.3互补

4、脱氧核糖核酸ComplementaryDNA,cDNA以信使核糖核酸为模板，在反转录酶作用下进行反转录所得到的脱氧核糖核酸。3.4病原微生物PathogenicMicroorganism指可以侵犯机体，引起感染的微生物。病原微生物指玩毒体、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。3.5寄生虫Parasite指具有致病性的低等真核生物，为在宿主或寄主体内或附着于体外以获取维持其生存、发育或者繁殖所需的营养或者庇护的一切生物。4主要仪器4.1 低温冰箱。4.2 生物安全柜。4.3 超净工作台。4.4 涡旋振荡器。4.5 可调微量加样枪。4.6 高速离心机。4.7 PCR仪。4.8 电泳

5、仪。4.9 凝胶成像系统。4.10 10恒温培养箱。4. 11恒温摇床。4.12 生物显微镜。4.13 水浴锅。4.14 高压灭菌锅。5病原检测项目4.15 原微生物4.15.1 须检测项目犬瘟热病毒CanineDistemperVirus猫泛白细胞减少症病毒FelinePanleukopeniaVirus轮状病毒Rotavirus金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus侵袭性大肠杆菌EnterinvasiveE.coli布氏杆菌Brucella4.15.2 要时补充检测项目犬腺病毒CanineAdenovirus犬冠状病毒CanineCoronavirus乙型脑炎病毒Encep

6、halitisBVirus肺炎克雷伯菌KlebsiellaPneumoniae4.16 生虫5. 2.1必须检测项目巴贝斯虫Babesia西氏贝蛔虫BaylisascarisSchroederi婢虫Ixodidae5.2.2必要时补充检测项目隐胞子虫CryPiOSPoridilUn蠕形蜻Demodex弓形虫Toxoplasmagondii6病原检测方法6. 1病原微生物犬瘟热病毒，检测核酸，方法见附录A；轮状病毒，检测核酸，方法见附录B；猫泛白细胞减少症病毒，检测核酸，方法见附录C；犬腺病毒，检测核酸，方法见DB51/T1710.7-2013；犬冠状病毒，检测核酸，方法见DB51/T17104

7、2013；乙型脑炎病毒,检测核酸，方法见DB51T1710.182016；金黄色葡萄球菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.16-2013；侵袭性大肠杆菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.5-2013；布氏杆菌，检测抗体，方法见GB/T18646-2018；肺炎克雷伯菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.14-2013；6.12 寄生虫巴贝斯虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录D；西氏贝蛔虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录E；隐抱子虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB51T23892017;婢虫,显微镜观察，方法见DB51/T171092013；蠕形蜻，

8、显微镜观察，方法见DB51T1710.102013；弓形虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB5IZT2387-2017。7病原检测规则6.13 采样方式样品的采集、运输和保存按照SNT21232008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。按照病原检测（病毒、细菌、寄生虫）所需样品要求联合取样。在行为训练条件下非麻醉或者麻醉状态下采集大熊猫的粪便、肛拭子、口咽拭子、鼻拭子、血液、毛发或皮屑、乳汁或胸腹水等样本。7. 2送检要求样品和样品送检单需尽快送达实验室，如实、详细填写样品送检单上的动物信息（个体谱系号或呼名）、样品名称、采样日期、数量、检测项目等内容。如不能立即送检，则样品需根据

9、不同的检测项目选择相应的保存方式。检测病原核酸的样本应保存在-20C或-80C冰箱内,细菌培养和寄生虫镜检样品需4保存,在48h内送检。8结果判定及结论根据使用的试剂及方法说明，进行结果判断；未见阳性结果，判断为阴性结果；出现阳性或可疑结果时，应在使用一个疗程药物治疗或间隔2个潜伏期后进行二次检测，二次检测结果为阳性或可疑结果时判定为阳性。根据检测结果出具检测报告，检测报告应包括动物信息、样本信息、检测方法、检测结果和结论。9废弃物处理废弃物处理按照GBzTl9489-2008实验室生物安全通用要求7.19执行。附录A(规范性附录)大熊猫犬瘟热病毒反转录RT-PCR检测方法A.1样品采集与处理

10、样本为大熊猫的口咽拭子或新鲜粪便，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。A.2待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA,反转录为cDNAo反转录体系见表AJo表A.1犬瘟热病毒的反转录体系组分加入体积(L)总RNA28AMVBuffer10IOMmdNTP7RandomPrimer(N9N6)IOligod(T)Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50室温孵育IOmin,42水浴1-1.5hoA3RT-PCR反应引物参照

11、地方标准引物上游引物(5,-3,):Cgagtctttgagatagggtt下游引物(5,-3,):CctccaaagggttcccatgaA.4对照设立阳性对照：取已知犬瘟热病毒阳性CDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。A.5RT-PCR反应体系及条件A.5.1RT-PCR反应体系见表A.2o表A.2犬瘟热病毒的RT-PCR反应体系组分加入体积(L)上游引物下游引物CDNA模板112ddH2O8.5总体系25A.5.2RT-PCR反应条件95预变性3min后循环开始，95变性30s,50退火30s,72延伸Imin,共35个循环，72最后延伸71抽。A.5.3RT-PCR

12、扩增产物大小产物大小：454bpoA.5.4RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%X脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。A.6结果判定阳性对照出现454bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现454bp目的片段时，判定犬瘟热病毒阳性；未出现454bp目的片段时，判定犬瘟热病毒阴性。附录B(规范性附录)大熊猫轮状病毒反转录RT-PCR检测方法7.12 样品采集与处理样本为大熊猫的肛拭子或新鲜粪便样品，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SNZT2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规

13、范执行。7.13 待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA,反转录为cDNA。反转录体系见表B.1。表B.1轮状病毒的反转录体系组分加入体积(L)总RNA28AMVBuffer10IOMmdNTP7RandomPrimer(N9N6)1Oligod(T)Primer1AMVreversetranscriptase2RRIItotal50反应程序：3745min,855s,4保存。7.14 RT-PCR反应引物上游引物(5,-3,):Tggtattgaatataccacaat下游引物(5,-3,):Aaggatggcccacaggatcag7.15 对照设立阳

14、性对照：取已知轮状病毒阳性质粒CDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。7.16 RT-PCR反应体系及条件7.16.1 RT-PCR反应体系见表B.2。表B.2轮状病毒的PCR反应体系组分加入体积(L)2TaqPCRMastermix12.5下游引物1CDNA模板2CidH2O8.5总体系257.16.2 RT-PCR反应条件95C预变性5min后循环开始，94变性30s,55退火30s,72延伸30s,共30个循环，72最后延伸IOminO7.16.3 RT-PCR扩增产物大小产物大小：340bp。7.16.4 RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2

15、%X脂糖凝胶电泳检测(120V,30min),通过凝胶成像系统观察结果。7.17 结果判定阳性对照出现34ObP的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阳性；未出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阴性。附录C(规范性附录)大熊猫猫泛白细胞减少症病毒巢式PCR检测方法Cl样品采集与处理样本为大熊猫的肛拭子和粪便样品，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SNZT2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范执行。C.2待测样品DNA提取及反转录将样品按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNAoC.3巢式PCR反应引物C.3.1NSl巢式PCR反应引物