细胞工程PPT.ppt

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1、 细胞工程细胞工程原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体植物原生质体：是去掉细胞壁的裸细胞。保持着植物细胞是去掉细胞壁的裸细胞。保持着植物细胞的全能性，而且仍能进行植物细胞的各种生命活动。是植的全能性，而且仍能进行植物细胞的各种生命活动。是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料。物细胞工程和许多理论研究的理想材料。Eg:利用原生质体可以进行植物细胞膜的结构与功能，细胞壁的形成与功能，病毒侵染机理，植物激素作用机理等多方面的研究。是植物遗传转化的理想受体，而且为实现远源物种间的体细胞杂交，培育新种开辟了新的途径。植物细胞的全能性原生质体的分离与纯化原生质体的分离原生质体的纯化与活力测定原生质体的分离

2、1、材料的选择由于叶肉细胞排列疏松，且叶肉原生质体有叶绿体，取材也方便，因此叶肉是最常用的材料。对于单子叶植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒较小，疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系更容易获得高质量的原生质体，在培养中更容易得到持续的细胞分裂。无菌幼苗的子叶，下胚轴和根等也可用于原生质体的分离。供体的年龄，生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，也影响实验的重复性。Eg:从生长在人工气候箱中的烟草植株的叶片获得的结果比田间材料得到的结果较稳定，并易于重复。2、材料的预处理、材料的预处理作用：生理状态，增加细胞膜的可能是改变细胞和细胞壁的强度；也可能

3、是改变细胞壁的化学成分或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。方法：（1）暗处理（2）预培养（3）预萎焉（4）预质壁分离3、分离方法（1）机械分离法：是早期研究中借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。（2）酶分离法：酶分离法是指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离，以获得原生质体。常用酶的种类：纤维素酶（cellulase);果胶酶（pectinase)；半纤维素酶（hemicellulase);崩溃酶（driselase);蜗牛酶（sanailase)。酶液的配置：一般由不同的酶制品、渗透稳定剂（糖醇、可溶性糖以及无机盐）以及稳定质膜的

4、药品（附加钙盐0.1%）组成，有时也加入少量缓冲剂或其他药品。（3）分离原生质体：a、两步分离法 b、一步分离法机械法机械法优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大图示：原生质体分离过程（以叶片为例）图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶原生质体的纯化与活力测定1、原生质体的纯化、原生质体的纯化将包括处理过的材料在内的酶解混合液经过尼龙网或不锈钢网过滤（网孔视原生质体的大小而异），除去大的残渣，然后收集含原生质体的滤液，再洗涤纯化。方法:（1）沉降法：）沉降法：将滤液低速离心，转速的控

5、制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍然悬浮在上清液为准。（2）漂浮法：）漂浮法：是根据原生质体、细胞或细胞碎片相对密度不同而设计的，但用这种方法纯化，原生质体得率较低。（3）界面法：）界面法：是利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，离心可使原生质体处于两液相的界面之间，可获得数量较大的纯净原生质体。界面法界面法500mmol/L蔗糖蔗糖 140mmol/L蔗糖蔗糖+360mmol/L山梨醇山梨醇原理：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。另一种溶液小于原生质体的密度。

6、100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇山梨醇+原生质体原生质体2、原生质体活力的测定、原生质体活力的测定（1）形态特征）形态特征形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形原生质体为有活力的原生质体。（2）活体染色）活体染色用0.1%酚番红或Evans蓝染色后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体不着色，而死亡的原生质体能被染上色。（3）其他）其他还可以用氧电极测定呼吸或测定原生质体的光合活性（绿色细胞）等方法来测定其活力。真正确定原生质体的活力还是要看原生质体能否进行持续有丝分裂并再生植株。原生质体活力检测原生质体活力检测形态识别：形态识别：形态上完整，形态上完整，呈圆形，

7、含有饱呈圆形，含有饱满的细胞质，颜满的细胞质，颜色鲜艳的即为存色鲜艳的即为存活的原生质体活的原生质体。原生质体的活力测定-染色法原生质体培养 培养基培养方法原生质体的再生培养操作实例：三叶半夏的原生质体培养 培养基1、无机盐、无机盐一般认为原生质体培养基中大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低，对其培养效果影响最大的是钙离子浓度和氮源的种类及其浓度。2、渗透稳定剂、渗透稳定剂常用的有葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖醇和麦芽糖等。糖类是培养基中碳源，也同时是培养基渗透势的调节剂。3、有机成分、有机成分含有丰富有机物质的培养基有利于细胞分裂，如被广泛应用于原生质体培养的KM8p培养基。4、植物生长

8、物质、植物生长物质一般认为，在培养基中加入2,4-D对分化却有抑制作用，因此，在愈伤组织形成后应该及时调整激素的种类和浓度。培养方法1、液体培养、液体培养（1）液体浅层培养 将一定的原生质体悬液在培养皿底铺一薄层，封口后进行培养。（2）微滴培养 微滴的大小很重要2、固体培养、固体培养-琼脂糖包埋琼脂糖包埋利用低熔点琼脂糖，可在30度左右溶化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。（对混合时的温度要求十分严格）3、液体、液体-固体结合培养固体结合培养（1）双层培养 固体培养和液体浅层培养相结合（2）琼脂糖珠培养 通过调整液体培养基的渗透势来调节培养物的渗透势，以利于其进一步的生长和发育。4、饲

9、喂层培养、饲喂层培养用洗涤过的经辐射处理过的原生质体作为饲喂层，再将未经辐射的原生质体铺在上面进行培养。原生质体培养方法原生质体培养方法原生质体再生培养原生质体的再生过程是指原生质体在适当的培养方法和良好原生质体的再生过程是指原生质体在适当的培养方法和良好条件下，先形成新的细胞壁，然后再生细胞持续分裂形成细条件下，先形成新的细胞壁，然后再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或胚状体获得再生植株的过程。胞团，最后或通过愈伤组织或胚状体获得再生植株的过程。1、细胞壁再生、细胞壁再生 细胞壁的再生能力和速度与供体植物的种类和其体细胞的分化程度及生理状态有关。研究烟草叶肉组织原生质体再生细胞壁

10、主要成分时发现，原生质初生细胞壁的成分与供体不同。2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成原生质体再生出完整细胞壁后，才能进入细胞分裂阶段，但再生出壁的细胞并不一定都能进行有丝分因此原生质体植板率因其供体植物不同有很大差异。当那些可持续分裂的细胞形成小的细胞团时，一般应将他们转接至无渗透稳定剂的培养基中，按一般的组织培养方法进行培养。3、植株再生、植株再生原生质体培养形成的愈伤组织转移到分化培养基中，可以经器官发生或体细胞胚胎发生再生植株。两步成苗法：先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（一般0.52.0mg/l)和低浓度2,4-D（一般0.020.2mg/l）的分化培养基上

11、，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。4、操作实例：三叶半夏的原生质体培养、操作实例：三叶半夏的原生质体培养a:first division,10 days after protoplast isolationb,c:2 and 3 wo microcolonies.d,e:4 and 6 wo microcallif:8 wo microcalli just before being transferred onto B5 mediumabcdefihgRecovery of plantlets through somatic embryogene

12、sisg:Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos.h:Transfer of globular embryos onto B5 medium for maturation of somatic embryos.i:Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.原生质体的分离、培养与再生过程示意图体细胞杂交原生质体的选择原生质体诱导融合的方法杂种细胞的选择

13、与鉴定杂种植株的鉴定体细胞杂种的遗传特征 番茄和马铃薯的番茄和马铃薯的属间体细胞杂种属间体细胞杂种“Potamato”。去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体融合原生质体融合 白菜白菜甘蓝甘蓝植物体细胞杂交：植物体细胞杂交：即植物原生质体融合（protoplast fusion)，是将不同亲本的植物原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。可以达到利用远源基因改良植性状的目的。1、原生质体的选择、原生质体的选择应采取既容易融合，又利于杂种筛选，还能形成稳定遗传重组体，并能再生植物的原生质体亲本组合，才能期望获得较好的实验结果。需考虑以下几个方面：（1）获得的原生质体要多，活

14、力要强，遗传上要一致；（2）选择培养再生植物较易的材料作为融合亲本；（3）选择亲本应带有可供融合后识别异核体的性状，如颜色、核型及染色体差异等；（4）在异核体发育中有能选择杂种的标记性状，如营养突变体或对某药物敏感等；（5）若以育种为目的，两亲本的亲缘关系不宜过远；（6）根据需要可以选择含有部分遗传信息或部分染色体的一个亲本的亚原生质体和另一个亲本的正常原生质体融合。2、原生质体诱导融合的方法2.1无机盐诱导融合无机盐诱导融合最早被用作融合剂的无机盐是硝酸钠溶液。硝酸钠的作用是综合质膜表面的负电荷，使原生质膜紧密接触，从而促进细胞融合。该法融合频率低，尤其是当用于高度液泡化的叶肉原生质体时更是

15、这样。2.2聚乙二醇诱导融合聚乙二醇诱导融合Keller等（1973）建立了高钙-高PH法。Kao（高国楠）和 Michayluk（1974）发现聚乙二醇（PEG）是很好的融合剂，建立了聚乙二醇法，并在后来和高钙-高pH法结合使用，使大豆和豌豆的原生质体融合率最多高达50%。此法无种属特异性，可以进行各种植物之间无亲缘关系的物种间的原生质体融合，甚至是动物细胞之间的融合。PEG(聚乙二醇)处理 融合基本过程 2.3 电诱导融合技术电诱导融合技术该技术对原生质体没有毒害作用，融合率高，重复性好，操作简便，同时融合的条件便于控制。电融合不适合大小相差较大的原生质体融合，且设备昂贵。基本过程：第一步

16、、在交变电场作用下，使原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个电极间排列成串珠状。第二步、施以强度足够的直流电脉冲，使质膜发生可逆性电击穿，从而导致紧密接触的细胞融合在一起。两个电极间串珠状原生质体(聚乙二醇)处理3、杂种细胞的选择与鉴定、杂种细胞的选择与鉴定原生质体融合是非特异性的，可能会产生多种融合状态，包括来自原生质体融合是非特异性的，可能会产生多种融合状态，包括来自亲本原生质体融合形成的异核体亲本原生质体融合形成的异核体(heterokaryon),同一亲本原生质体同一亲本原生质体融合形成的同核体（融合形成的同核体（homokaryon）以及未发生融合的双亲本原生）以及未发生融合的双亲本原生质体，还有多核体。所以需要借助一些特殊的方法，把融合产物中质体，还有多核体。所以需要借助一些特殊的方法，把融合产物中的异核体筛选出来。方法有：的异核体筛选出来。方法有：3.1互补选择法互补选择法利用两个亲本具有不同的遗传和生理等特征，在特定培养条件下，只有能产生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。此方法要求亲本有某些遗传缺失、营养缺陷或对药物的不同抗性等前提条件。（1）营养缺陷型互补选择（2）抗