第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术.ppt

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1、第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素一、重组DNA导入大肠杆菌的方法相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。2.转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。3.转染(transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染：噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。（一）转化（一）转化

2、（transformation）（1）热激法（）热激法（heat shock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化一、重组DNA导入大肠杆菌的方法1、化学转化法感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性，制备感受态细胞。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法一、重组DNA导入大肠杆菌的

3、方法细菌感受态细胞的制备过程培养大肠培养大肠杆菌杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收离心收集菌集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心收离心收集菌集菌4离心收离心收集菌集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬一、重组DNA导入大肠杆菌的方法重组体导入受体细胞10ng载体载体DNA100 L感受态菌感受态菌 On ice混合，静混合，静置置30分钟分钟37摇摇1小时小时10-100 L转化液涂含抗转化液涂含抗菌素的平板菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入

4、DNA加入加入1mL LB培培养基养基42C 1.5分钟分钟简单，但转化效率不高（简单，但转化效率不高（10106 6-10-108 8/gDNAgDNA）。）。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法平板培养基培养细菌平板培养基培养细菌10-10010-100 L L转化液转化液涂于含抗菌素的平板涂于含抗菌素的平板3737过夜过夜一、重组DNA导入大肠杆菌的方法2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理:用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DN

5、A)通过这些小孔进入细胞.转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）一、重组DNA导入大肠杆菌的方法LB培养受体菌培养受体菌至至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2离心集菌离心集菌冰冷的水重悬菌体冰冷的水重悬菌体2 离心集菌离心集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2 离心收离心收集菌体集菌体少量冰冷的水少量冰冷的水重悬重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA On ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37 中速震荡中速震荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液

6、涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化电击转化法电击转化法（二）（二）转导转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程移过程（三）（三）转染转染噬菌体噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每每 g DNA能形成能形成106个噬菌斑个噬菌斑 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染 体外包装过程 （一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.原生质体转化原生

7、质体转化2.2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化3.3.PEG1000PEG1000转化法转化法4.4.电击法电击法（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞1.利用原生质体进行转化利用原生质体进行转化 酵母原生质体感受态酶去壁酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体转转化化转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%酵母0.1mol/L LiCl 处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子 吸

8、收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个/g DNA；共转化现象极少4.电击转化电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/g DNA（3）单链转化率高于双链3.PEG1000转化转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.载体介导的转化（农杆菌介导）载体介导的转化（农杆菌介导）2.2.DNADNA直接导入（基因抢法、电击法等）直接导入（基因抢法、电击法等）3.3.种质系统法（花粉管通道法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞（二）导入植

9、物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株在饲养平皿的滤纸上培养2天又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸

10、附金属微粒加速，进入受体细金属微粒加速，进入受体细胞胞基因枪基因枪装入装入外植体制备外植体制备轰击轰击外植体培养及选择外植体培养及选择基因枪基因枪1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入混合入电击缓冲电击缓冲液液电击处电击处理理愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化选择培养选择培养（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法2.2.脂质体介导法脂质体介导法3.3.显微注射法显微注射法4.DEAE-4.DEAE-葡萄糖转染法葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（

11、三）导入动物细胞（三）导入动物细胞原理：原理：（三）导入动物细胞1.磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。脂质体包埋脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。脂质体（脂质体（lipofectinlipofectin）载体法）载体法应用玻璃显微注射器，直接把外源应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段）外

12、源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核雄原核4）受精卵移植）受精卵移植显微注射法显微注射法(microinjection)(microinjection)二乙氨乙基（二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源外源DNA细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理吸附到

13、细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以可以进入到细胞核里。进入到细胞核里。导入外源DNA的几种方法转化率（转化率（cfu/gDNA）：每微克重组每微克重组DNA转化转化后，接纳后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。隆数。（一）转化率的计算：（一）转化率的计算：转化率 产生菌落的总数/DNA的加入量 例：取1l（0.1 ng/l）完整的质粒转化100l的感受态细胞。向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？转化率1000/0.01 ng DNA=108

14、 cfu/g 例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu/mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？104 107 cfu/mg 10-2 a 20%重组载体 a=0.5 mg普通的亚克隆实验：110 6 cfu/g DNA；更复杂的亚克隆：1107 cfu/g DNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：1108 cfu/g DNA。1）载体）载体DNA类型、大小；重组类型、大小；重组DNA浓度、浓度、纯度纯度2）受体细胞）受体细胞3）转化方法：同一转化方法）转化方法：同一转化方法技术参数技术参数影响影响转化率转化率（二）转化率的影响因素（二）转化率的影响因素 影响转化率的因素 （2）感受态细胞（competent cells)生长状态制备 感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70以下 使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。