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1、细胞凋亡细胞凋亡(Cell apoptosis)一、概述一、概述二、细胞凋亡的信号通路二、细胞凋亡的信号通路三、重要的凋亡控制基因三、重要的凋亡控制基因四、细胞凋亡的检测四、细胞凋亡的检测主主 要要 内内 容容目的与要求目的与要求了解细胞凋亡的概念及调控机制了解细胞凋亡的概念及调控机制掌握细胞凋亡的特征掌握细胞凋亡的特征熟悉研究细胞凋亡的方法熟悉研究细胞凋亡的方法学会根据课题需要选择研究方法学会根据课题需要选择研究方法一、概一、概 述述（一）细胞死亡的研究历史（一）细胞死亡的研究历史（二）细胞凋亡的概念（二）细胞凋亡的概念（三）细胞凋亡的特征（三）细胞凋亡的特征（四）细胞凋亡与细胞坏死（四）细

2、胞凋亡与细胞坏死19761993184219721983-19861985-1988198019731989199119911996199319961997Carl Vogt-cell deathJohn Kerr first used“apoptosis”John Sulston-apoptosiscedBcl-2 apoptosis and DNA degradationLadder DNAFas was discoveredP53 Cloning of FasBaxCaspase namedICECED-3.Yuan JY,Cell 1993cytochrome cApaf-1（一）（一

3、）Sydney Brenner,H.Robert Horvitz,John E Sulston Apoptosis in C.elegans70s(1)Cell 1993(H Robert Horvitz)(2)Cell 1993(3)Science 1994(4)Cell 1994(5)Nature 1997(6)Cell 1998(7)Cell 1998(8)Cell 1999(9)Nature 2000(10)Nature Cell Biol 2001(11)Nature 2003(12)Cell 2003(13)Cell 2004(14)Nat Chem Biol 2005(15)Ce

4、ll 2005(16)Science 2005(17)Nat Cell Biol 2007 袁钧英袁钧英 Yuan J.1.Cell 1994(Goldstein JL and Brown MS)2.Cell 1996(cytochrome c)3.Science 19974.Cell 19975.Cell 1997 Apaf-16.Cell 1997 Apaf-1/caspase-9 complex 7.Cell 19988.Nature Cell Biol 19999.Cell 200010.Nature Cell Biol 200011.Nature 2001 12.Science 20

5、0313.Cell 200414.Cell 2005王晓东王晓东Wang XD（二）细胞凋亡的概念（二）细胞凋亡的概念What is apoptosisa form of cell death in which a controlled sequence of events(or program)leads to the elimination of cells without releasing harmful substances into the surrounding area Also called programed cell death or cell suicide Necro

6、ptosis-programmed necrosis-like death -inhibitor(Nec-1)（三）细胞凋亡的特征（三）细胞凋亡的特征 1.形态学特征形态学特征细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞体积变小，细胞质浓缩。胞膜结构完整，有泡状突起。胞膜结构完整，有泡状突起。细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。细胞膜内陷形成凋亡小体细胞膜内陷形成凋亡小体(Apoptotic bodies)。无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。细胞膜泡状化（blebbing）Caspase 3剪切膜蛋白，干扰膜蛋白的代谢。剪切膜蛋白，干

7、扰膜蛋白的代谢。2.细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征 染色质染色质DNA断裂断裂,形成形成180200bp整数倍的整数倍的DNA片段；片段；细胞内的酶被激活；细胞内的酶被激活；细胞内活性氧分子增多、胞浆钙离子升高。细胞内活性氧分子增多、胞浆钙离子升高。膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面 线粒体膜电位消失，膜通透性变大，细胞色线粒体膜电位消失，膜通透性变大，细胞色素素C被释放。被释放。Shen YX et al,J Pineal Res 2002;32:163-167(四四)Necrosis VS.Apoptosis二、细胞凋亡的信号通路二、细胞凋亡的信号通路（一）

8、内源性通路（线粒体途径）（一）内源性通路（线粒体途径）（二）外源性通路（死亡受体途径）（二）外源性通路（死亡受体途径）:Fas,TNF,Trail.（三）共同终末：（三）共同终末：caspase激活，启动细胞凋激活，启动细胞凋亡进程亡进程（一）内源性通路：线粒体途径（一）内源性通路：线粒体途径（Intrinsic pathway）Mitochondrial pathway 线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在细胞线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在细胞内源性的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心内源性的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置。位置。细胞内部的死亡信号源自各种因素，如细胞内部的

9、死亡信号源自各种因素，如DNA损伤、损伤、氧化应激、氧化应激、X-射线、化疗药物、营养缺乏等。射线、化疗药物、营养缺乏等。因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径。的内源途径。线粒体介导凋亡的大致过程：线粒体介导凋亡的大致过程：损伤因素损伤因素线粒体跨膜电位（线粒体跨膜电位（）的消失和线粒体渗透）的消失和线粒体渗透转运孔（转运孔（PTP）的开放）的开放细胞色素细胞色素C从线粒体中从线粒体中的释放和的释放和Caspase-9的激活。的激活。错误造就发现 破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞质裂解液中破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞

10、质裂解液中被破坏被破坏 如果用凋亡分子刺激细胞，发现细胞色素如果用凋亡分子刺激细胞，发现细胞色素c的确从线粒体的确从线粒体释放到细胞质中释放到细胞质中-线粒体参与了凋亡的反应线粒体参与了凋亡的反应 当用细胞色素当用细胞色素C的抗体特异地除掉细胞色素的抗体特异地除掉细胞色素c后，细胞质后，细胞质裂解液不能结合裂解液不能结合dATP（二）外源性通路（二）外源性通路（Extrinsic pathway）1.Fas/FasL pathway1）Fas/FasL蛋白：蛋白：Fas又称又称CD95或或凋亡蛋白凋亡蛋白-1(Apo-1)，分子量，分子量约为约为43kD43kD，成熟蛋白长，成熟蛋白长3193

11、19氨基酸。胞膜外区有氨基酸。胞膜外区有3 3个富含半胱氨酸的结构域个富含半胱氨酸的结构域 (cysteine-rich domain,CRD)，其中有，其中有2 2个个N-N-糖基化位点。胞糖基化位点。胞浆部分含有浆部分含有7070个左右个左右DD(death domain)区。区。FasL分子量约分子量约40kD，成熟蛋白长，成熟蛋白长281个个氨基酸氨基酸。2）分布：）分布：Fas表达比较广泛，胸腺、心脏、肝、肺、肾和卵巢等都表达比较广泛，胸腺、心脏、肝、肺、肾和卵巢等都有表达。与有表达。与Fas分布广泛性不同的是，分布广泛性不同的是，FasL通常只出现通常只出现于活化的于活化的T细胞和

12、细胞和NK细胞。细胞。3）Fas诱导凋亡的途径：诱导凋亡的途径：Fas-FADD-Caspase-8 FasL与与Fas结合后，结合后，Fas三聚体化。三聚体化。通过通过DD区的蛋白质之间的相互作用，区的蛋白质之间的相互作用，Fas与与FADD(fas associated death domain)结合，形成结合，形成DISC(death inducing signaling complex)。通过通过FADD的的DED(death effector domain)区，区，Procaspase-8 被募集在被募集在DISC上。上。1.Fas/FasL pathwayFas-FasL path

13、way2.TNF pathway TNF(Tumor necrosis factor):TNF 由活化的单核巨噬由活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶液质素；细胞产生，亦称恶液质素；TNF 由活化的由活化的T细胞产生，亦细胞产生，亦称淋巴毒素。称淋巴毒素。两种两种TNF的分子量为的分子量为51kD，结构为同源三聚体，结构为同源三聚体，TNF-和和TNF-都可以分别与都可以分别与TNFR或或TNFR结合，并且与结合，并且与这两型受体的结合基本上没有选择性。这两型受体的结合基本上没有选择性。TNFR特点特点 TNFR又称为又称为TNFR55，胞膜外区有，胞膜外区有4个个CRD，其中有，其中有3个个N-糖

14、基化位点。胞浆区有糖基化位点。胞浆区有3个蛋白激酶个蛋白激酶C(PKC)作用位点，作用位点，1个蛋白酪氨酸激酶个蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位点。的作用位点。TNFR又称为又称为TNFR75，胞膜外区也有，胞膜外区也有4个个CRD，其中有，其中有2个个N-糖基化位点。跨膜区有糖基化位点。跨膜区有1个个PKC作用位点。作用位点。TNFR与与TNFR在胞膜外区有在胞膜外区有28%的同源性，在胞浆的同源性，在胞浆区没有同源性。区没有同源性。TNFR在胞浆区有一个约在胞浆区有一个约80个氨基酸的个氨基酸的DD区，区，TNFR没有同样的结构域没有同样的结构域，但其，但其C端的端的78个氨基个氨基酸残基

15、可以结合信号转导蛋白酸残基可以结合信号转导蛋白TRAF2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-2)等胞浆信号蛋白，等胞浆信号蛋白，在信号转导中发挥重要作用。在信号转导中发挥重要作用。TNF诱导的凋亡途径诱导的凋亡途径 TNFR-TRADD(TNF receptor-associated death domain protein)-FADD-Caspase-8 TNF与与TNFR结合后，结合后，TNFR三聚体化。三聚体化。通过通过DD区，区，TRADD 不但可以结合不但可以结合TNFR的胞浆区，也的胞浆区，也可以结合可以结合FADD的

16、的C-端部分。端部分。通过通过FADD的的DED区，区，Procaspase-8 被募集在被募集在DISC上。上。聚集的聚集的Procaspase-8或或10，通过自身或相互切割产生成，通过自身或相互切割产生成熟的熟的Caspase-8或或10。TNFR活化转录因子活化转录因子NF-B的信号也是通过的信号也是通过TRADD介导的，介导的，TRADD在通过在通过C端部分的端部分的DD区与区与TNFR胞浆胞浆区结合后，可以与另一种信号转导蛋白区结合后，可以与另一种信号转导蛋白TRAF2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-2)结合，结合，TRAF2 再通过再通过NIKIKKIB通路引起通路引起NF-B的活化，的活化，使细胞存活。使细胞存活。TNF诱导的细胞存活途径诱导的细胞存活途径TNF pathway3.TRAIL pathway TRAIL又称凋亡蛋白又称凋亡蛋白2配体（配体（Apo2 ligand）;由由281个氨基酸组成，分子量个氨基酸组成，分子量32kD;其胞膜外其胞膜外C端区域与端区域与FasL和和TNF的同源性分别